響應(yīng)面優(yōu)化涉縣無核黑棗果酒發(fā)酵工藝

昝立峰，楊香瑜，張策，李景旭

（1.邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北邯鄲056005；2.河北省高校冀南太行山區(qū)野生資源植物應(yīng)用研發(fā)中心，河北邯鄲056005）

黑棗，學(xué)名君遷子（Diospyros lotusL.），屬于柿樹科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros），落葉喬木[1-2]。果實(shí)脫澀后生食，或者釀酒制醋，廣泛分布在中國北方地區(qū)，河北的涉縣、贊皇，山西的平順、左權(quán)，山東的鄒平、淄博，湖南的洞口等地均有成片的栽培[3-4]。主要分為有核和無核兩種，黑棗入脾胃經(jīng)，能補(bǔ)中養(yǎng)氣、養(yǎng)血、安神及明目，多用于補(bǔ)血和作為調(diào)理藥物，對貧血、血小板減少、肝炎、乏力、失眠有一定的療效[5-7]。

黑棗果實(shí)中含有豐富的營養(yǎng)成分，是研制多種食品、飲料、保健品以及果酒的理想原料，所含蛋白質(zhì)包括人體自身不能合成的丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、纈氨酸、組氨酸、精氨酸。維生素含量非常豐富，包括VA、VC、VE等，尤其VC含量極為豐富，每百克新鮮黑棗中含有VC97.9 mg，是蘋果、梨、桃、杏等水果的14～32 倍[8-9]。同時(shí)黑棗中含有大量的多酚類化合物，包括沒食子酸、沒食子酸甲酯、倍酸甲酯、鞣花酸、單寧酸、山萘酚、槲皮素、楊梅素等，這些多酚化合物具有良好的抗氧化、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜和抑制HIV-1 病毒的作用[10-13]。

本試驗(yàn)以河北涉縣產(chǎn)無核黑棗為原料，采用響應(yīng)面法對發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，研發(fā)出一種口感協(xié)調(diào)，營養(yǎng)價(jià)值較高的保健型果酒，旨在為進(jìn)一步精深加工黑棗奠定基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)資源的深度開發(fā)利用，推動產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)升級和效益提升，帶動涉縣林產(chǎn)業(yè)和傳統(tǒng)初加工業(yè)的轉(zhuǎn)型和綜合協(xié)調(diào)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無核黑棗于2017年11月采自河北省涉縣井店鎮(zhèn)；安琪果酒酵母、安琪黃酒高活性酵母、安琪釀酒曲（紹酒風(fēng)味）：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（酶活力10 萬U/g）：河南臻玉實(shí)業(yè)有限公司；檸檬酸（食品級）：濰坊英軒實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司；白砂糖：北京康普匯維科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BioFlo/CelliGen115 發(fā)酵罐：New Brunswick Scientific公司；PHS-3E pH 酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PAL-1 數(shù)顯折射儀、PAL-33S 酒精濃度計(jì)：廈門森態(tài)儀器儀表有限公司；MKJ-J1-4 型實(shí)驗(yàn)室微波爐：青島邁威微波技術(shù)應(yīng)用有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑棗果酒發(fā)酵工藝流程

果實(shí)精選→清洗→切片→熱水浸提→果膠酶處理→調(diào)糖→調(diào)酸→高溫滅菌→接種發(fā)酵→后發(fā)酵→澄清過濾→灌裝→檢驗(yàn)→成品

1.3.2 指標(biāo)測定方法

糖度測定：數(shù)顯折射儀進(jìn)行測定；酒精度測定：酒精濃度計(jì)測定發(fā)酵液的蒸餾液中的酒精度；還原糖含量、大腸菌群和菌落總數(shù)按照NY/T 1508—2017《綠色食品果酒》中的方法測定[14]。

1.3.3 無核黑棗果酒發(fā)酵的單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 發(fā)酵菌種篩選及其接種量的影響

將涉縣無核黑棗切成1 mm～2 mm 的薄片，稱取100 g 于燒杯中加入純水500 mL，置于微波爐中在功率為400 W 條件下微波處理5 min，然后于85 ℃下浸提得到黑棗汁，用白砂糖將還原糖含量調(diào)到20%，檸檬酸調(diào)節(jié)pH 3.5，向250 mL 錐形瓶中個(gè)加入100 mL黑棗汁，在黑棗汁中分別加入安琪果酒酵母、安琪黃酒高活性酵母、安琪釀酒曲（紹酒風(fēng)味），接種量分別為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%，在25 ℃條件下發(fā)酵9 d，分別測量酒精度。

1.3.3.2 發(fā)酵初始pH值的影響

將浸提得到的黑棗汁還原糖含量調(diào)到20%，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH值分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，在棗汁中加入0.2 %的安琪黃酒高活性酵母，25 ℃條件下發(fā)酵9 d，分別測量酒精度。

1.3.3.3 發(fā)酵溫度的影響

將浸提得到的黑棗汁還原糖含量調(diào)到20%，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH 3.5，在棗汁中加入0.2%的安琪黃酒高活性酵母，分別置于15、20、25、30、35 ℃的條件下發(fā)酵，9 d 后測量酒精度。

1.3.3.4 發(fā)酵時(shí)間的影響

將浸提得到的黑棗汁還原糖含量調(diào)到20%，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH 3.5，在棗汁中加入0.2%的安琪黃酒高活性酵母，在25 ℃的條件下分別發(fā)酵6、7、8、9、10 d 后分別測量酒精度。

1.3.4 無核黑棗果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-behnken 的中心組合設(shè)計(jì)原理，選取發(fā)酵初始pH值（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）3 個(gè)影響較大的因素為自變量，以黑棗果酒的酒精度為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法對涉縣無核黑棗果酒的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對響應(yīng)面法得到的最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響無核黑棗果酒發(fā)酵的單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵菌種及其接種量的影響

發(fā)酵菌種及其添加量對酒精度的影響見圖1。

3 種釀酒酵母發(fā)酵黑棗果酒酒精度隨著接種量增加而增加，整體觀察發(fā)現(xiàn)安琪黃酒高活性酵母為發(fā)酵菌種的酒精度最高，在接種量為0.2%時(shí)，酒精度為13.97%vol，而果酒酵母和安琪釀酒曲發(fā)酵的酒精度最高分別為12%vol 和11%vol，因此選擇安琪黃酒高活性酵母為發(fā)酵菌種。當(dāng)黃酒高活性酵母菌種接種量較小時(shí)，代謝繁殖慢，且抗性較弱，導(dǎo)致原料代謝轉(zhuǎn)化為酒精不徹底，酒精度低；而當(dāng)黃酒高活性酵母接種量過高時(shí)，酒精度反而降低；當(dāng)接種量為0.2%時(shí)，酒精度達(dá)到最高為13.97%vol，且酒體品質(zhì)良好，因此以安琪黃酒高活性酵母添加量為0.2%比較合適。

圖1 發(fā)酵菌種及其添加量對酒精度的影響Fig.1 Effects of fermentation strains and inoculating amount on alcoholicity

2.1.2 發(fā)酵初始pH值的影響

發(fā)酵液中pH值對酵母細(xì)胞中酶的活性影響較大，從而影響酒精的產(chǎn)量，其對酒精度的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵初始pH值對酒精度的影響Fig.2 Effects of fermentation pH on alcoholicity

由圖2可知，在其他條件相同的情況下，隨著發(fā)酵液初始pH值的增加，酒精度逐漸增加，當(dāng)初始pH值為3.5 時(shí)，黑棗果酒的酒精度達(dá)到最高為14.5%vol，而當(dāng)pH值高于3.5 后，釀酒酵母生長和代謝酶系活性被抑制，酒精度逐漸降低，因此選擇初始發(fā)酵液pH值為3.5。

2.1.3 發(fā)酵溫度的影響

溫度對酵母菌的生長繁殖和次級代謝產(chǎn)物的形成都具有重要的影響，發(fā)酵溫度對酒精度的影響見圖3。

黑棗果酒的酒精的體積分?jǐn)?shù)在15 ℃～35 ℃區(qū)間呈現(xiàn)先增后減的趨勢，而當(dāng)溫度為25 ℃～30 ℃時(shí)，黑棗果酒的酒精度為15.2 %vol，而高于30 ℃時(shí)，酒精度呈下降趨勢，高溫影響酵母菌活性和代謝途徑中酶系活力，同時(shí)發(fā)酵溫度過高會產(chǎn)生不良發(fā)酵味，影響果酒的口感[15-17]。因此選擇發(fā)酵溫度為25 ℃～30 ℃比較合適。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間的影響

發(fā)酵時(shí)間對酒精度的影響見圖4。

圖3 發(fā)酵溫度對酒精度的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on alcoholicity

圖4 發(fā)酵時(shí)間對酒精度的影響Fig.4 Effects of fermentative time on alcoholicity

黑棗酒的酒精度與發(fā)酵時(shí)間呈正相關(guān)，在發(fā)酵前9 d 時(shí)，酒精度增長較快，之后發(fā)酵速度趨于緩慢，原因?yàn)榘l(fā)酵液中的糖轉(zhuǎn)化較完全，此時(shí)測定還原糖含量2.3 %左右，酒精發(fā)酵基本接近終點(diǎn)，為了保持果酒口感，選擇發(fā)酵時(shí)間為9 d 較為適宜。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案，以黑棗果酒酒精度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平，因素水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析

通過統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert.V8.06 對表2 中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次線性回歸擬合分析，得到回歸方程為：Ln（酒精度）=14.76+0.20A+1.35B+0.20C-0.75AB+1.30AC+2.20BC-0.81A2-1.81B2-3.26C2

對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

模型P=0.010 7＜0.05，表明回歸模型方程顯著，擬合度較好；失擬項(xiàng)P=0.077 7＞0.05，不顯著，說明通過試驗(yàn)得到的二次回歸方程能較好地預(yù)測結(jié)果[18-19]。其中一次項(xiàng)B、BC交互項(xiàng)以及二次項(xiàng)B2、C2均表現(xiàn)為顯著，由此可知這些一次、交互項(xiàng)、二次項(xiàng)對涉縣無核黑棗果酒發(fā)酵的影響較為明顯；在模型互交項(xiàng)中，AB、AC交互項(xiàng)的顯著性較差，說明發(fā)酵與單因素并不是簡單的線性關(guān)系。方差分析可知，試驗(yàn)所選因素對響應(yīng)值影響的強(qiáng)弱次序依次為：溫度＞時(shí)間＞pH值。

表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析表Table 3 ANOVA for the regression response surface model

2.2.3 交互項(xiàng)擬合響應(yīng)值分析

對各變量的交互項(xiàng)進(jìn)行二元回歸模型分析，得到三維響應(yīng)面分析圖以及等高線[20]圖見圖5。由圖可以直觀看出各因素及其交互值對響應(yīng)值的影響、變化趨勢以及各因素在所選范圍內(nèi)存在的極值。

圖5 各變量互相作用對酒精度影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects on alcoholicity

圖5中（a、b、c）響應(yīng)面上標(biāo)記的最高點(diǎn)即為最大值，說明在所選分析的因素水平范圍內(nèi)存在極值。等高線的形狀均為近橢圓型，在一定程度上反映了交互項(xiàng)對黑棗果酒發(fā)酵酒精度的顯著性，當(dāng)發(fā)酵溫度高于26 ℃時(shí)，等高線變化稀疏（圖5a），說明對發(fā)酵酒精度影響減弱，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。從圖5b 等高線中發(fā)現(xiàn)pH值和發(fā)酵時(shí)間均對酒精度有一定的影響，而發(fā)酵時(shí)間為中間水平9 d 時(shí)，等高線變化稀疏。圖5c 中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度比發(fā)酵時(shí)間對果酒酒精度的影響大。

為了確定最佳響應(yīng)值的因子組合，計(jì)算得到的數(shù)學(xué)回歸模型的一階偏導(dǎo)數(shù)，得出的最佳條件為：發(fā)酵溫度27.44 ℃、初始pH 3.53、發(fā)酵時(shí)間9.21 d，理論酒精度為15.12%vol。考慮實(shí)際因素以及操作條件，將涉縣無核黑棗酒發(fā)酵工藝的最佳參數(shù)調(diào)整為：發(fā)酵溫度27℃、初始pH 3.5、發(fā)酵時(shí)間9 d。在此工藝條件下3 次試驗(yàn)取平均值，得到的涉縣無核黑棗果酒的酒精度平均值為15.37%vol，與理論預(yù)測值相差0.25%vol，說明此次響應(yīng)面分析法優(yōu)化后所得到的黑棗酒的發(fā)酵條件較為準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 黑棗果酒質(zhì)量指標(biāo)

2.3.1 感官指標(biāo)

色澤：橙黃色至棕黃色，透明清亮，無沉淀物；香氣：愉悅的酒香和黑棗果香，無異味；口味：清爽，柔順；典型性：酒體協(xié)調(diào)、完整，典型性突出。

2.3.2 理化指標(biāo)

酒精度：15%vol ～16%vol；還原糖含量≤4 g/L。

2.3.3 微生物指標(biāo)

大腸菌群≤3.0 MPN/mL；細(xì)菌總數(shù)≤50 CFU/mL；致病菌：未檢出。

3 結(jié)論

本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以黑棗果酒的酒精度為考查指標(biāo)，通過Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化，建立了黑棗果酒的發(fā)酵工藝條件，研發(fā)一種口感協(xié)調(diào)，果香濃郁以及營養(yǎng)價(jià)值較高的保健型果酒，對解決產(chǎn)量過剩和深加工問題，促進(jìn)太行山資源開發(fā)利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。最終得到黑棗果酒最佳發(fā)酵工藝條件參數(shù)為：安琪黃酒高活性酵母接種量0.2%、發(fā)酵pH值為3.5、發(fā)酵溫度27 ℃、發(fā)酵天數(shù)9 d，在此條件下的黑棗酒品質(zhì)最佳，黑棗果酒的酒精度為15%vol 左右。