XAD-7型大孔樹脂純化黑果腺肋花楸多酚條件優(yōu)化

張卉，王亞茹，劉洋峰

（沈陽(yáng)化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110142）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa），又名野櫻莓、不老莓，簡(jiǎn)稱黑果。研究表明，黑果果實(shí)具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，尤其是其中的多酚含量是目前已知果實(shí)中最高的，每100 g 鮮果中所含的多酚可達(dá)2 050 mg 沒食子酸當(dāng)量～2 560 mg 沒食子酸當(dāng)量[1-2]。近年來(lái)，隨著多酚降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤等多種生理功能的發(fā)現(xiàn)[3-7]，有關(guān)黑果多酚是生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，如高凝軒等[1]和仇洋[5]分別用大孔樹脂純化黑果多酚提高其純度。由于目前國(guó)外對(duì)黑果多酚純化的報(bào)道較少，提取物純度仍較低，不利于對(duì)其藥用價(jià)值及生物活性等進(jìn)一步的研究，也不利于原料藥及功能食品的開發(fā)。大孔樹脂是一類不溶于酸、堿和各種有機(jī)溶劑，具有較好吸附性的有機(jī)高分子聚合物[8]，其富集效果明顯、解吸條件溫和、不受無(wú)機(jī)物影響、可多次再生、使用周期長(zhǎng)，近年來(lái)大孔樹脂在多酚類活性物質(zhì)的分離純化的應(yīng)用越來(lái)越多[9-10]。本文通過考察大孔樹脂對(duì)黑果多酚的純化效果，為多酚類物質(zhì)的進(jìn)一步研究以及工業(yè)化生產(chǎn)提供方法及理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)原料及試劑

黑果腺肋花楸凍果：遼寧華益農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；HPD600 型、S-8 型、HPD450 型、XAD-7型、AB-8型和X-5 型大孔樹脂：北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水乙醇、鹽酸和氫氧化鈉：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Folin-Phenol 試劑：北京博奧拓達(dá)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（YP10002）：上海光正醫(yī)療儀器有限公司；振蕩水浴鍋（B-220）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE52CS），上海亞榮生化機(jī)器廠；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-ⅢS）：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；紫外光分光光度儀（T6）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；振蕩培養(yǎng)箱（HZQF160）：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；電熱恒溫干燥箱（202-2 型）：上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；pH計(jì)（pH-300 型）：上海天達(dá)儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)（FD-1C-50）：上海喬躍電子有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 黑果多酚粗提液的制備

采用改良的令博等[11]的方法：將黑果解凍后打漿，在乙醇體積濃度60%、液料比1∶20（g/mL）、提取溫度50 ℃的條件下提取20 min，抽濾，旋蒸。

2.2 黑果多酚含量和純度的測(cè)定

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，用Folin-Phenol 法[12]測(cè)定黑果多酚粗提液中多酚的含量，多酚的純度經(jīng)-80 ℃冷凍干燥后參考曹增梅等[13]的方法計(jì)算。

2.3 大孔樹脂的篩選

稱取經(jīng)預(yù)處理[14]的XAD-7、X-5、AB-8、HPD600、S-8 和HPD450 型大孔樹脂各5.0 g 分別置于6 個(gè)錐形瓶中，每瓶加入50 mL 黑果多酚粗提液，在25 ℃、120 r/min 的條件下恒溫振蕩?kù)o態(tài)吸附24 h，量取上清液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，在波長(zhǎng)760 nm 條件下測(cè)定其吸光度值，并計(jì)算其吸附量和吸附率；吸附飽和的樹脂濾出后用蒸餾水沖洗至無(wú)色，吸除多余的水分，再加入50 mL 體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，用保鮮膜密封瓶口，在25 ℃，120 r/min 的條件下進(jìn)行靜態(tài)解吸24 h，量取上清液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，測(cè)定其吸光度值并計(jì)算解吸率。根據(jù)吸附率和解吸率選擇純化效果較優(yōu)的大孔樹脂[15]。相關(guān)計(jì)算公式如下所示：

式中：C0：樣品液起始濃度，mg/mL；C1：吸附平衡時(shí)多酚溶液濃度，mg/mL；V：樣品溶液體積，mL；m：樹脂質(zhì)量，g；C2：解吸液中多酚濃度，mg/mL。

2.4 XAD-7型大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸黑果多酚的動(dòng)力學(xué)曲線的繪制

分別在上述吸附和解吸條件下每0.5 h 取1 mL 上清液測(cè)定多酚含量，并繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線和靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線。

2.5 XAD-7型大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸黑果多酚的影響因素的研究

2.5.1 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

在上述靜態(tài)吸附條件下，分別考察不同上樣液質(zhì)量濃度（稀釋2、3、4、5、6、7 倍）和不同上樣液pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）對(duì)XAD-7型大孔樹脂靜態(tài)吸附效果的影響。

2.5.2 靜態(tài)解吸試驗(yàn)

在上述條件下，分別考察不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液（40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%）和不同乙醇溶液pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）對(duì)XAD-7型大孔樹脂靜態(tài)解吸效果的影響。

2.6 XAD-7型大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸黑果多酚的影響因素研究

精確稱取一定量（濕重）XAD-7型大孔樹脂，濕法裝入1.8×40 cm 的層析柱中，填充高度為30 cm，將黑果多酚粗提液以一定流速進(jìn)行上樣，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，吸附完全后用蒸餾水去除上樣液中不能被樹脂吸附的雜質(zhì)，最后用95%乙醇溶液進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫[16-17]。

2.6.1 上樣流速和上樣量對(duì)XAD-7型樹脂吸附效果的影響

多酚上樣流速分別設(shè)定為1、2、4、8 mL/min 和16 mL/min，收集未能吸附的黑果多酚流出液，測(cè)定流出液中多酚的A760nm并計(jì)算其含量和吸附量，確定最佳的上樣量。

2.6.2 洗脫流速對(duì)XAD-7型樹脂解吸效果的影響

將黑果多酚粗提液以一定的流速注入層析柱中進(jìn)行吸附，待樹脂吸附飽和后，用95 %乙醇溶液進(jìn)行動(dòng)態(tài)解吸并調(diào)節(jié)其流速，洗脫流速設(shè)定為1、2、4、8 mL/min 和16 mL/min，收集黑果多酚流出液，測(cè)定流出液中多酚的A760nm并計(jì)算其含量和解吸率。

2.7 數(shù)據(jù)分析

采用origin9.0 軟件作圖，SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的平均值，結(jié)果表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3 結(jié)果與討論

3.1 大孔樹脂的篩選

黑果多酚的大孔樹脂靜態(tài)吸附及解吸效果見表1。

表1 6種大孔樹脂對(duì)黑果多酚的靜態(tài)吸附及解吸效果Table 1 The static adsorption and desorption results of six macroporous resins on polyphenols

如表1所示，在所研究的6種大孔樹脂中，S-8 和XAD-7型對(duì)多酚的吸附效果顯著優(yōu)于其他樹脂，AB-8 和XAD-7型的解吸效果顯著優(yōu)于其他樹脂。綜合各型號(hào)樹脂的吸附和解吸情況，選用XAD-7型大孔樹脂作為黑果多酚的純化樹脂進(jìn)行下一步研究。

3.2 不同吸附時(shí)間下XAD-7型大孔樹脂對(duì)黑果多酚的靜態(tài)吸附-解吸效果

大孔樹脂對(duì)黑果多酚的靜態(tài)吸附及解吸情況見表2。

如表2所示，隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，XAD-7型樹脂對(duì)黑果多酚的吸附量也逐漸增大；當(dāng)吸附到2.5 h 時(shí)樹脂對(duì)黑果多酚的吸附量達(dá)到了穩(wěn)定，隨后XAD-7型樹脂的吸附量增加較為緩慢。隨著解吸時(shí)間的延長(zhǎng)，XAD-7型樹脂對(duì)黑果多酚的解吸率沒有顯著變化（p＞0.05）。

表2 XAD-7型大孔樹脂對(duì)黑果多酚的靜態(tài)吸附及解吸效果Table 2 The static adsorption and desorption results of XAD-7 macroporous resin on polyphenols

3.3 XAD-7型大孔樹脂對(duì)黑果多酚靜態(tài)吸附-解吸條件的影響因素

3.3.1 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)XAD-7型樹脂靜態(tài)吸附效果的影響

上樣液質(zhì)量濃度對(duì)樹脂吸附效果的影響見圖1。

圖1 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)樹脂吸附量的影響Fig.1 The effect of sample concentration on adsorption quantity of resin

如圖1所示，當(dāng)黑果多酚上樣液質(zhì)量濃度為2.67 mg/mL 以下時(shí)，隨著上樣液質(zhì)量濃度的增加，XAD-7型大孔樹脂對(duì)多酚的吸附量也隨之增加。當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為2.67 mg/mL 以上時(shí)，吸附量下降。造成這種現(xiàn)象的原因是當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度較大時(shí)，有少量黑果多酚未被樹脂吸附，易產(chǎn)生沉淀，堵塞樹脂，造成多酚吸附量的下降；當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為2.67 mg/mL 以下時(shí)，有部分樹脂尚未達(dá)到飽和，樹脂的使用效率較低[18-19]。因此，上樣液質(zhì)量濃度為2.67 mg/mL 左右最佳。

3.3.2 上樣液pH值對(duì)XAD-7型樹脂靜態(tài)吸附效果的影響

上樣液pH值對(duì)樹脂靜態(tài)吸附效果的影響見圖2。

圖2 上樣液pH值對(duì)樹脂吸附量的影響Fig.2 The effect of pH value on adsorption quantity of resin

如圖2所示，當(dāng)黑果多酚上樣液pH值在2～4 范圍內(nèi)時(shí)，大孔樹脂對(duì)多酚的吸附量因pH值的増大而顯著升高；而上樣液pH值在4～7 時(shí)，隨著pH值的升高，多酚吸附量降低。這是由于上樣液pH值的變化，可以改變目標(biāo)成分在溶液中存在的形式，改變?nèi)芤簶O性，影響目標(biāo)成分與大孔吸附樹脂的分子間作用力。黑果多酚中含有大量酚羥基，呈酸性，在酸性條件下比較穩(wěn)定，從而利于大孔樹脂對(duì)多酚的吸附[1]。

3.3.3 洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)XAD-7型樹脂靜態(tài)解吸效果的影響

洗脫劑的體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹脂靜態(tài)解吸率的影響見圖3。

圖3 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹脂解吸率的影響Fig.3 The effect of eluent concentration on desorption rate of resin

如圖3所示，隨著洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，多酚的解吸率也隨之提高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到95%時(shí)，解吸率最高。這是由于洗脫劑和相應(yīng)的洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)大孔樹脂的選擇遵循相似相溶的原理[20]。XAD-7型大孔樹脂屬于弱極性的樹脂，而本試驗(yàn)所選的乙醇洗脫劑中，95%乙醇溶液的極性最小，所以其效果最好。因此，選用95%乙醇溶液作為洗脫劑。

3.3.4 洗脫劑的pH值對(duì)XAD-7型樹脂靜態(tài)解吸效果的影響

洗脫劑pH值對(duì)樹脂靜態(tài)解吸效果的影響見圖4。

圖4 洗脫劑pH值對(duì)樹脂解吸率的影響Fig.4 The effect of pH value of eluent solution on desorption rate of resin

如圖4所示，乙醇溶液pH值在2.0～7.0 范圍內(nèi)，隨著pH值的升高黑果多酚解吸效果明顯增強(qiáng)；在pH值為7.0 時(shí)達(dá)到最大值，解吸率高達(dá)88.48%；當(dāng)pH值大于7.0 時(shí)，解吸效果隨pH值增加呈下降趨勢(shì)。因此，洗脫劑最佳的pH值為7.0。

3.4 XAD-7型樹脂對(duì)黑果多酚的動(dòng)態(tài)吸附-解吸的影響因素

3.4.1 黑果多酚的上樣流速和上樣量對(duì)XAD-7型樹脂吸附的影響

上樣流速和上樣量對(duì)樹脂吸附效果的影響如圖5所示。

圖5 上樣流速對(duì)樹脂吸附效果的影響Fig.5 The effect of different flow rates on the adsorption of resin

由圖5可知，在上樣液濃度為2.76 mg/mL、上樣流速為1、2、4、8 mL/min 和16 mL/min 時(shí)，泄漏點(diǎn)發(fā)生在吸附量分別為430、390、330、290、210 mL 附近；當(dāng)流速為1 mL/min 時(shí)，樹脂吸附量最大。隨著上樣液體積的增加，流出液中多酚的濃度逐漸增大。上樣流速過快時(shí)，會(huì)使得黑果多酚沒有足夠的時(shí)間被大孔樹脂吸附，導(dǎo)致吸附效果降低。當(dāng)流出液中多酚濃度達(dá)到上樣液多酚質(zhì)量濃度的1/10 時(shí)，被認(rèn)為已經(jīng)產(chǎn)生泄漏[5]。在動(dòng)態(tài)吸附過程中，當(dāng)層析柱中樹脂吸附多酚樣液開始出現(xiàn)泄漏時(shí)，終止吸附，此時(shí)為吸附的最佳狀態(tài)[21]。因此，選擇上樣流速為1 mL/min，上樣量為430 mL。

3.4.2 洗脫劑乙醇溶液的洗脫流速對(duì)XAD-7型樹脂解吸效果的影響

乙醇溶液的洗脫流速對(duì)樹脂洗脫效果的影響如圖6所示。

圖6 乙醇溶液的洗脫流速對(duì)樹脂洗脫效果的影響Fig.6 The effect of elution flow rate of ethanol solution on the elution of resin

在吸附條件相同的情況下考察不同洗脫流速對(duì)XAD-7型大孔樹脂解吸效果的影響。由圖6可知，洗脫液以1 mL/min 進(jìn)行洗脫得到的峰形相對(duì)較窄且拖尾狀況不顯著，以2、4、8 mL/min 和16 mL/min 進(jìn)行洗脫得到的峰形較寬且拖尾狀況比較顯著，因此選擇洗脫流速為1 mL/min 最為合適，此流速條件下洗脫體積為210 mL。在此條件下計(jì)算多酚純度由9.56%提高到74.26%。

4 結(jié)論

通 過 對(duì) 比XAD-7、X-5、AB-8、HPD600、S-8、HPD450 型大孔樹脂對(duì)黑果多酚吸附-解吸的效果發(fā)現(xiàn)，XAD-7型大孔樹脂能夠較好的純化黑果多酚，其最佳靜態(tài)吸附-解吸工藝條件為：上樣液質(zhì)量濃度2.76 mg/mL，上樣液pH值4.0，吸附時(shí)間2 h；洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)95 %，pH值7.0，解吸時(shí)間1 h。最佳動(dòng)態(tài)吸附-解吸工藝條件為：上樣量430 mL，上樣流速1 mL/min，洗脫體積210 mL，洗脫流速1 mL/min。在此條件下，黑果多酚提取物純度由9.56 %提高到74.26 %，表明XAD-7型大孔樹脂能夠較好地純化黑果多酚。