荸薺皮中色素的提取工藝優化

汪建紅

（1.內江師范學院化學化工學院，四川內江641110；2.四川省高等學?！肮悘U棄物資源化”重點實驗室，四川內江641110）

荸薺是一種在中國有三千年種植歷史的水果，在我國有較大的種植面積，達到5 萬hm2以上，年產量達百萬噸以上[1-2]。荸薺味甜多汁，深受人們喜愛，有“地下雪梨”的美稱[1]。常被作為垃圾拋棄的荸薺皮富含多種有效成分，其中就包括色素。荸薺皮色素作為一種天然色素，安全無毒副作用，甚至具有一定的療效和保健功能，研究荸薺皮中色素的提取意義重大[3-8]。

色素常用的提取方法有有機溶劑浸提法、堿法、微波法、超聲波法等。有機溶劑浸提法[9-13]浸提時間長、效率低，分離效果不好。堿法[5]操作簡便，但會產生大量腐蝕性較強的廢液，對環境帶來了較大的負面影響。微波法[13-17]和超聲波法[13，18-20]高效省時，但微波和超聲波對人體會帶來較大的負面影響。酶法[21-25]利用破壁作用來降低傳質阻力幫助提取，操作簡便，且效率較高，也尚未見在荸薺皮色素提取中應用的記載。常見的酶中木瓜蛋白酶活力值高、易溶解、后處理容易，而且還可催化蛋白質水解，減少蛋白質對提取的影響，因此該試驗采用木瓜蛋白酶的方法提取荸薺皮色素，并優化提取工藝條件，為其進一步開發利用提供理論基礎。

1 儀器與試劑

1.1 試劑及材料

荸薺：四川內江農貿市場；木瓜蛋白酶（生物試劑，活力值≥80 萬U/g）：上海源葉生物科技有限公司；乙酸鈉、乙酸、無水乙醇（均為分析純）：成都金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

T-6 型紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；7230G 型可見分光光度計：上海洪紀儀器設備有限公司；DF-101S 型恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州英峪予華儀器有限公司；TDL-5-A 型低速大容量離心機：上海安亭科學儀器廠；FA2204A 型電子天平：上海精天電子儀器有限公司；DFT-100 型手提式萬能高速粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司；SHB-B95 型循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；CS101-2AB 型電熱鼓風干燥箱：重慶試驗設備廠。

2 試驗方法

2.1 測定波長的選擇

稱取1.00 g 荸薺皮干粉加入到圓底燒瓶中，再加入20 mL 利用pH值為5 的水溶液配制的體積濃度為30%的乙醇溶液，40 ℃下回流2 h，沸水浴滅酶，冷卻，離心取清液，過濾，將濾液在50 mL 容量瓶中，用乙醇定容。從容量瓶中取出液體，在300 nm～600 nm 范圍內利用紫外分光光度計掃描，發現在430 nm 處有一強吸收峰，與文獻數據[26]相符，因此選擇430 nm 為測定波長。

2.2 荸薺皮色素的提取和測定

稱取1.00 g 荸薺皮干粉加入到圓底燒瓶中，按照一定液料比加入利用pH值為5 的水溶液配制的一定體積濃度的乙醇溶液，在一定溫度下回流一定時間，沸水浴滅酶，冷卻，離心取清液，過濾，將濾液在50 mL 容量瓶中，用乙醇定容。

從50mL 容量瓶中取出2.00 mL 溶液，加入到25 mL比色管中，用蒸餾水稀釋到10 mL。比色管中取出液體在430 nm 波長位置，測定其吸光度值。由于比爾-朗伯定律[27]，吸光度與濃度之間存在良好的線性關系，所以本試驗以吸光度值的大小反映荸薺皮色素提取的效果。

2.3 單因素試驗

在荸薺皮質量1.00 g 的條件下，利用單因素試驗考查乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）、酶用量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1（mL/g）]、溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）和提取時間（1、2、3、4、5 h）的影響。

2.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以乙醇濃度、酶用量、液料比、溫度和時間5 個因素，每個因素4 個水平，設計L16（45）正交表并安排試驗，重復2.2 的操作。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗

3.1.1 乙醇濃度對色素提取效果的影響

乙醇濃度對荸薺皮色素提取效果的影響如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對色素提取效果的影響Fig.1 Influence of ethanol concentration on extraction effect of pigment

從圖1可看到隨著乙醇濃度的增加，提取液的吸光度越來越大；當乙醇體積濃度達到70%后，繼續增大乙醇濃度，提取液吸光度值沒出現明顯增大。這是由于荸薺皮色素在乙醇中溶解度較大，乙醇濃度越大，則能溶解進入溶液的荸薺皮色素越多，當乙醇濃度達到70%時，荸薺皮色素已經基本完全進入溶液中，而且乙醇濃度的增加也會導致一些難溶于乙醇的樹脂狀雜質量的增加，同時木瓜蛋白酶在乙醇中溶解度較小，乙醇濃度太大時可能會使木瓜蛋白酶不能均勻分散甚至以固體形式析出，導致活力值得不到充分發揮，使荸薺皮色素的提取受到影響。因此，綜合考慮得率和節約資源，選擇乙醇濃度為70%。

3.1.2 酶用量對色素提取效果的影響

酶用量對荸薺皮色素提取效果的影響如圖2所示。

從圖2可看到，隨著木瓜蛋白酶用量的增加，從吸光度變化可看到荸薺皮色素得率逐漸增加；當酶用量達到0.5%后，隨著酶用量的繼續增加提取液吸光度沒有出現明顯的變化。這是由于木瓜蛋白酶具有破壁作用，酶用量越大，則破壁能力越強，越有利于荸薺皮色素從荸薺皮組織解吸進入溶液中，但當酶用量達到0.5%時，其破壁能力幾乎已發揮到極致。因此，考慮到節約資源，選擇酶用量為0.5%。

圖2 酶用量對色素提取效果的影響Fig.2 Influence of enzymatic dosage on extraction effect of pigment

3.1.3 液料比對色素提取效果的影響

液料比對荸薺皮色素得率的影響如圖3所示。

圖3 液料比對色素提取效果的影響Fig.3 Influence of liquid-solid ratio on extraction effect of pigment

從圖3可看到，隨著溶劑用量的增加，吸光度先逐漸增加，后逐漸降低，當液料比為35∶1（mL/g）時達最大值。這是由于溶劑越多，能溶解的荸薺皮色素越多，但溶解帶出的脂溶性雜質也越多，導致傳質阻力增大使荸薺皮色素的析出受到抑制。因此，選擇液料比為35∶1（mL/g）。

3.1.4 溫度對色素提取效果的影響

提取溫度對荸薺皮色素提取效果的影響如圖4所示。

圖4 溫度對色素提取效果的影響Fig.4 Influence of temperature on extraction effect of pigment

從圖4可看到在30 ℃～50 ℃溫度范圍內，隨提取溫度升高，吸光度逐漸增大，當溫度為50 ℃達最大值；此后在50 ℃～80 ℃范圍內，隨溫度的升高，吸光度逐漸下降。這是由于溫度越高，分子運動越活躍，就會有更多的荸薺皮色素進入并溶于溶液中，但溫度過高時，分子運動過快，會導致荸薺皮色素從荸薺皮組織解吸進入溶液中的通道受阻，也會導致已進入溶液的部分荸薺皮色素氧化變質。因此，選擇提取溫度為50 ℃。

3.1.5 時間對色素提取效果的影響

提取時間對荸薺皮色素提取效果的影響如圖5所示。

圖5 時間對色素提取效果的影響Fig.5 Influence of time on extraction effect of pigment

從圖5可看到在1 h～4 h 范圍內，隨著提取時間的增大，作為反映荸薺皮色素提取效果指標的吸光度逐漸增加；當達到4 h 時，達最大值；此后隨時間的延長吸光度開始出現下降的趨勢。這是由于時間越長，則解吸進入溶液中的荸薺皮色素越多，但時間過長也會導致浸出的部分色素在酶作用下分解變質。因此選擇提取時間為4 h。

3.2 正交試驗

根據單因素試驗的結果，以乙醇濃度、酶用量、液料比、溫度和時間為因素的L16（45）正交表的正交試驗設計、試驗結果及極差分析結果見表1，方差分析結果見表2。

表1 L16（45）正交試驗試驗設計及結果Table 1 L16（45）orthogonal experimental design and results

表2 正交試驗結果方差分析Table 2 Variance analysis of the orthogonal experiment results

從表1可看到，最佳水平組合為A4B4C3D3E4，即乙醇濃度90%，酶用量0.7%，液料比35∶1（mL/g），提取溫度60 ℃，提取時間5 h。

從表2 的方差分析可知在所選擇的正交試驗因素水平范圍內，因素A、B 即乙醇濃度、酶用量的影響，均達到非常顯著的水平（p＜0.01），因素C、E 即液料比和提取時間的影響達到了顯著的水平（p＜0.05），因素D 即提取溫度的影響不顯著。而F 值結果表明，各因素影響的主次順序為：A（乙醇濃度）＞B（酶用量）＞E（提取時間）＞C（液料比）＞D（提取溫度）。

對正交試驗結果作了3 次平行試驗驗證，所得吸光度值分別為0.888、0.890、0.910，平均值0.896，高于正交試驗表中的值，說明了正交試驗結果的正確性。

4 結論

本試驗利用木瓜蛋白酶提取荸薺皮色素的最佳工藝條件為：乙醇濃度90 %，酶用量0.7 %，液料比35∶1（mL/g），提取溫度60 ℃，提取時間5 h。最佳條件下所測得的荸薺皮色素提取液的吸光度值為0.896，高于相同條件下不使用酶時的測得值0.769。該結論為荸薺皮色素的開發利用提供了基本參考依據。