再生纖維素凝膠對乳清分離蛋白預乳化液穩定性的影響

趙尹毓，田筱娜，周光宏，張萬剛*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095）

食品乳化液是一種熱力學不穩定體系[1-2]，容易出現失穩現象，乳化液失穩后會發生脂肪顆粒上浮、油水兩相分離以及底部出現沉淀等現象，嚴重影響到產品的貨架期和感官品質[3]。

有研究表明，蛋白質是一種大分子表面活性劑，能夠在脂肪顆粒表面上吸附并定向排列形成界面吸附層，降低脂肪球界面張力，防止脂肪顆粒間的聚結，提高分散體系的穩定性[4]。但是蛋白質穩定的乳化液對pH值、溫度和離子強度等環境條件十分敏感，尤其在蛋白質等電點附近、高溫處理或較高離子強度下，乳狀液易發生粒徑增大、乳狀液分層等脫穩現象，限制了其在食品加工過程中的應用[4-5]。

前期研究發現不同多糖、變性淀粉及改性纖維素可以提高乳化液的黏稠度，吸附于液滴表面增加界面膜的厚度，在乳化液中形成凝膠結構提供空間屏障，改變食品體系的物理特性，降低液滴的運動速率，提高乳化液的穩定性[6-8]。微晶纖維素（microcrystalline cellulose，MCC）是一種水不溶性纖維素，由于分子間氫鍵作用力強而導致其表面活性差，只能通過吸水溶脹穩定乳化液[9-10]。由MCC通過磷酸溶解和水再生得到的凝膠態再生纖維素（regenerated cellulose，RC）具有較高的表面活性，具有疏水和親水基，因此具有很強的增稠能力[11]。將纖維素多糖與蛋白質組合，可以通過增加脂肪球周圍的吸附層的厚度以及形成一定的空間位阻，改善乳液體系的穩定[3,12]。

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）營養性良好，且具有乳化特性、起泡特性和凝膠特性，在食品加工中常被用作乳化劑或發泡劑等[13]。由WPI穩定的橄欖油乳化液粒徑小，營養價值好，可被用作脂肪替代物生產低脂肉制品[14]。但由于WPI容易受到加工環境條件的影響，如pH值、溫度、離子強度等，使橄欖油乳化液發生粒徑增大，乳化液分層等脫穩現象。

本研究旨在向WPI-橄欖油預乳化液中添加不同比例RC凝膠，通過測定乳化液表觀穩定性、分層指數、乳滴粒徑大小、乳化液流變特性以及觀察微觀結構的變化情況，研究RC凝膠對WPI-橄欖油預乳化液穩定性的影響，為提高蛋白質乳化液穩定性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

歐麗薇蘭橄欖油 市購；MCC 山東曲阜天利藥用輔料有限公司；牛乳WPI（含蛋白質90%） 河南正興食品有限公司；85%磷酸（食品級） 江蘇澄星磷化工有限公司。

1.2 儀器與設備

LSHZ-300型冷凍水浴恒溫振器 常州諾基儀器有限公司；Beckman Avanti J-E離心機 美國Beckman Coulter公司；Ultra Turrax T-25 Basic高速勻漿機、C-MAG HS7磁力攪拌器 德國IKA公司；FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱上海森信實驗儀器有限公司；Masterizer 3000激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；MCR301旋轉流變儀奧地利安東帕（中國）有限公司；奧林巴斯FV3000激光共聚焦顯微鏡 南京奧力科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RC的制備

參照Jia Xuejuan等[15]的方法并稍作修改。取4 g MCC，用12 g去離子水潤濕、搖勻，加入160 mL 4 ℃預冷的85%食品級磷酸，獲得乳白色懸浮液；置于4 ℃振蕩器中以150 r/min轉速孵育24 h，獲得澄清、透明的纖維素膠體溶液；取出后加入800 mL去離子水混勻靜置2 h，然后16 500×g離心15 min，重復水洗離心至上清液pH值恒定在6.0～6.5之間，獲得半固體凝膠態的RC，采用烘箱稱重法測定RC最終質量分數為4.50%。

1.3.2 RC乳化液的制備

將2 g WPI充分溶解在20 mL去離子水中，然后加入橄欖油，12 000 r/min高速勻漿1.5 min獲得預乳化液；將RC和相應的去離子水加入預乳化液，繼續12 000 r/min勻漿1.5 min，最終得到RC乳化液。乳化液中橄欖油質量分數為30%，WPI的質量分數為2.0%，RC添加量分別為0%、0.4%、0.8%、1.2%和1.6%。為了避免勻漿過程中產熱使蛋白質變性，整個勻漿過程在冰浴中進行。

1.3.3 乳化液穩定性

將制備好的乳化液分別取12 mL于透明玻璃瓶中，室溫條件下靜置1 周，觀察記錄乳化液每天的分層情況，并拍照保存；乳化液分層指數是指乳化液在貯存期間下層（乳清層）的高度占乳化液總高度的比值，按公式（1）計算：

式中：Hs為實測下層清液高度/cm；Ht為乳化液的總高度/cm。

1.3.4 乳化活性

參考Diao Xiaoqin等[16]的方法并稍作修改。取50 μL乳化液，加入5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液混勻，在波長500 nm處測定樣品吸光度，記為A0；在乳化液制備完成的30 min和60 min時重復之前操作，測定吸光度為A30和A60。乳化活性按公式（2）計算：

式中：A為乳化液分別在0、30 min和60 min時的吸光度；C為乳化液中WPI質量濃度/（g/mL）；φ為乳化液中橄欖油的體積分數/%；N為稀釋倍數（100）。

1.3.5 粒度大小及分布

乳化液中油滴的粒度大小及分布通過Mastersizer 3000激光粒度分析儀測定，粒度大小以體積質量等效平均直徑（D4,3）表示。測定參數為：濕法進樣，顆粒折射率為1.476，吸收率為0.001；分散劑為水，折射率為1.330。測試前將乳化液分別用等體積的水和1.0% SDS稀釋[17]，可以通過兩者粒度大小的變化，按公式（3）計算乳化液滴的絮凝程度。

式中：D4,3-SDS為不加SDS時測定的乳化液滴直徑/μm；D4,3+SDS為加SDS時測定的乳化液滴直徑/μm。

1.3.6 流變特性

乳化液的流變特性通過MCR301旋轉流變儀測定，測定時溫度設定為25 ℃，轉子型號選擇PP50，間隙設置為0.5 mm。表觀黏度在0.01～101 s-1剪切速率范圍內測定，得到黏度隨剪切速率變化的曲線；動態振蕩掃描（儲能模量G′、損耗模量G′）在應變為0.1%，頻率為0.1～100 Hz范圍內測定，得到G′、G”隨頻率變化的曲線。

1.3.7 微觀結構

乳化液微觀結構通過激光共聚焦顯微鏡觀察，向5 mL乳化液中分別加入200 μL尼羅紅（0.01%）和200 μL尼羅藍（0.01%），充分混勻后置于搖床過夜染色。取微量染色乳化液，在488 nm（尼羅紅）和633 nm（尼羅藍）波長，置于60 倍目鏡下觀察乳滴的微觀結構及分布情況。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 乳化液穩定性結果

2.1.1 表觀穩定性

如圖1所示，乳化液制備后的初期在表觀上沒有顯著差異（圖1A），放置過程中，未添加RC的乳化液最先開始出現分層現象。放置7 d后，由圖1B可知，未添加RC的乳化液分層最為嚴重，在下層出現蛋白聚集物，且隨著放置時間的延長，乳化液的分層界面越來越明顯，乳化液體系是一種絮凝物與非絮凝物共存狀態[18]。隨著RC添加量的增加，分層現象得到了有效抑制，當添加0.8%及以上的RC時不再發生乳析分層，主要原因可能是RC凝膠的增稠能力增強，乳化液黏度增大。

圖1 RC添加量對乳化液表觀穩定性的影響Fig. 1 Effect of RC concentration on the visual appearance of emulsion

2.1.2 分層穩定性

圖2 RC添加量對乳化液分層指數的影響Fig. 2 Effect of RC concentration on the creaming index of emulsion

由圖2可知，添加0%和0.4% RC的乳化液均在第1天開始出現分層現象，分層指數分別為56.82%和27.27%，添加0.8%、1.2%和1.6% RC處理組的乳化液在存放時間內都沒有發生分層。這是由于當連續相中含有0.4% RC時，不能產生足夠高的黏度而形成弱凝膠，導致乳化液滴之間聚結，絮凝程度高，形成較大顆粒，所以分層較快。乳化液的分層穩定性隨RC添加量的增加而增強，主要原因可能是隨著RC添加量的增加，增加了連續相黏度，同時由于RC在乳化液中的空間位阻作用，使液滴粒度減小，液滴與連續相之間的密度差減小，分層穩定性提高。

2.2 乳化液粒度大小及分布

表1 RC添加量對乳化液粒度大小及絮凝程度的影響Table 1 Effect of RC concentration on the particle size and fl occulation degree of emulsion

圖3 RC添加量對乳化液粒度分布的影響Fig. 3 Effect of RC concentration on the particle size distribution of emulsion

如表1所示，在不添加SDS的情況下，隨著RC添加量的增加，乳化液液滴D4,3先減小后增大，添加1.2% RC時乳化液液滴大小顯著小于其他RC添加量處理組（P＜0.05）。如圖3所示，乳化液顆粒直徑的分布隨著RC添加量的增大整體趨勢向左偏移，且當RC添加量增加到1.2%時第3個峰消失，第2個峰高增加，即大粒徑的液滴減少，小粒徑液滴增加，表明粒度大小更加均勻。

在測定粒徑大小的過程中加入SDS是為了使WPI發生變性，導致吸附在乳滴表面的蛋白減少，引起乳化液發生絮凝現象[19]，利于研究RC對乳化液絮凝變化的影響。添加SDS與不添加SDS所測得的乳化液D4,3趨勢相同，但添加SDS的乳化液顆粒略小于不加SDS處理組，這是由于SDS使蛋白變性，吸附在表面的蛋白減少。不添加RC或添加量較低（0.4%）時乳化液的絮凝程度高，隨著RC添加量增加到1.2%時，乳化液絮凝程度顯著降低（P＜0.05），當RC添加量達到1.6%時，絮凝程度增加，說明RC只有在適當添加量條件下才可以抑制乳化液發生絮凝現象。

雖然RC是水不溶性多糖，但是可以通過氫鍵、疏水力與蛋白質相互作用，使其在乳化液體系中具有良好的分散性[20-21]。連續相中隨著RC添加量增加，乳化液黏度增大，為乳化液滴提供了良好的空間屏障，減緩了乳化液滴移動的速率，使乳化液之間聚結，絮凝程度降低，粒徑隨之減小[22]。但是當凝膠態RC添加量達到1.6%時，D4,3略有增加，可能是因為在連續相中RC添加量過多，導致液滴與液滴間隙過小，阻礙了均質過程中WPI在連續相中的移動以及在油滴表面的吸附作用[23]，或者把已經吸附在乳滴表面的蛋白排擠出來，進而使乳化液出現耗損絮凝，聚結在一起形成較大的顆粒[4]。Liu Liya等[24]研究結果與本實驗相似，乳化液中過量的羧甲基纖維素誘導乳化液發生耗損絮凝。分層現象與粒度大小、絮凝情況密切相關，當RC添加量達到1.6%時，雖然顆粒增大，絮凝程度升高，但由于其黏度過大，阻止了分層現象的發生（圖1）。

2.3 乳化液微觀結構

如圖4可知，沒有添加RC或添加量較低（0.4%）的乳化液油滴較大；RC添加量為0.8%時乳化液滴顯著減小，但油滴大小均一性不好；添加1.2% RC穩定的乳化液粒徑最小，且分布均勻，分散性好；RC添加量為1.6%時，油滴略有增大，并且出現乳滴聚集成團現象。乳化液微觀結構圖與乳化液粒度大?。ū?）的結果相一致。隨著RC添加量的增加，連續相中RC結構的增強，乳化液中RC添加量為1.2%時，表現出很強的增稠能力，同時RC可能在乳化液中形成網狀結構[15]，從而削弱了液滴與液滴間的聚集作用，使乳化液滴可以均勻地分散在連續相中，且保持較小的粒徑。有研究表明，山竹微纖化纖維素由于其較大的縱橫比，形成較強的相互作用和無序的網絡結構，阻礙了乳化液發生絮凝從而達到穩定乳化液的目的[25]。本研究中的RC具有與山竹微纖化纖維素類似的形態和凝膠特性。

圖4 RC添加量對乳化液微觀結構的影響Fig. 4 Effect of RC concentration on the CLSM micrograph of emulsion

2.4 乳化活性

表2 RC添加量對乳化液乳化活性的影響Table 2 Effect of RC concentration on the EAI of emulsion

如表2所示，在0 min條件下，從整體上看，乳化活性隨著RC添加量的增加呈增加趨勢，但是當添加量增加到0.8%及以上時差異不顯著，在30 min和60 min后，乳化液中添加了RC的乳化活性顯著高于沒有添加RC處理組（P＜0.05），尤其在60 min條件下，沒有添加RC的乳化活性僅為1.46 m2/g，而添加1.2% RC的乳化活性提高到4.55 m2/g。這證明RC在WPI乳化液中起到了良好的乳化作用，可以被認為是乳化穩定劑。這與乳化液粒度大小與分層穩定性的結果具有一致性，乳化活性越高，乳化液滴越小，導致乳化液穩定性越好。

2.5 乳化液流變特性

2.5.1 表觀黏度

圖5 RC添加量對乳化液表觀黏度的影響Fig. 5 Effect of RC concentration on the apparent viscosity of emulsion

如圖5所示，乳化液的表觀黏度隨剪切速率增加而降低，呈現出剪切稀化行為，屬于非牛頓假塑性流體[26]。乳化液黏度的變化主要是由于乳化液滴聚集狀態的變化，在剪切過程中乳化液液滴的絮凝結構遭到破壞[27]。沒有添加RC的乳化液表觀黏度最低，隨著RC添加量的增加，乳化液黏度逐漸增大。這是因為隨著RC添加量的增加，結合水的能力增強，增稠能力提高，體系的零剪切黏度增加，隨著剪切速率的增加，乳化液的內部結構被破壞，分子按照剪切速率的方向線性排列，樣品的黏度和剪切應力逐漸減小[28]。這與Hu Hongyan等[10]的研究結果具有一致性，可能是因為RC形成特定的空間網絡結構，而增大乳化液的黏度，高黏度可以抑制液滴的移動，防止其聚結和分層現象的發生，從而獲得更好的乳液穩定性。這些結果與乳化液的粒度大小和分層穩定性的結果相一致。

2.5.2 動態振蕩掃描特性

圖6 RC添加量對乳化液頻率掃描的影響Fig. 6 Effect of RC concentration on the frequency sweep of emulsion

動態振蕩實驗是研究乳化液黏彈性的重要方法，可以通過模量的大小顯示乳化液體系結構的強弱[29]。在應變保持1.0%不變，乳化液處于線性黏彈區，進行乳化液的G′和G”的測定，結果如圖6所示。不同乳化液的G′和G”隨著振蕩頻率的增加稍有增加趨勢，但隨著RC添加量的增加，G′和G”對頻率變化的依賴性降低，變化幅度減小，變化曲線趨于平穩，并且在線性黏彈性范圍內G′大于G”，表明乳化液屬于一種典型的彈性凝膠體系[1,30]，而且說明液滴間相互作用增強，乳化液內形成了穩定結構[7,31]，這種穩定的結構可能歸因于RC在流動相中形成凝膠狀網絡結構。

3 結 論

本實驗研究不同添加量的RC對WPI-橄欖油預乳化液穩定性的影響，MCC通過磷酸溶解、水再生得到的RC結晶區部分被破壞[15]，RC可以通過氫鍵和疏水作用在乳化液體系中有良好的分散性，而且凝膠態的RC相比與粉末狀的MCC具有更強的增稠能力[32]。隨著RC添加量的增加，乳化液的黏度增強，結構更加穩定。其中RC添加量為1.2%時，乳化液的粒徑最小，絮凝程度最低，穩定性最好。RC能夠穩定WPI乳化液的原因可能是RC凝膠的增稠作用，以及在乳化液中形成網絡結構，延緩液滴的移動，形成空間屏障防止液滴間的絮凝與聚結，從而起到穩定WPI-乳化液的作用。在30%橄欖油和2.0%的WPI預乳化液中，添加1.2% RC可以有效改善蛋白質預乳化液的乳化穩定性。