產2-苯乙醇酵母的鑒定及其在醬油發酵中的應用

鄒謀勇，朱新貴，劉 丹，李巧連

（李錦記（新會）食品有限公司，廣東 江門 529100）

醬油是以大豆、面粉等為主要原料釀造而成的一種傳統調味品[1]。隨著人們消費水平的不斷提高，對醬油風味提出了更高的要求[2]。近年來，在醬油風味物質的分析方法[3]、風味成分的組成[4-6]以及在醬油發酵各階段風味成分的形成機理[7-8]等領域開展了廣泛研究。醬油的呈味物質包括氨基酸、糖、有機酸、酯類、醇類、黃酮類等物質，其香氣成分包括揮發性、半揮發性酸類、酯類、醇類、醛酮類、酚類、雜環類化合物等[9-11]。由于酵母的代謝作用，醬油中醇類物質的種類非常豐富，這些醇類成分對醬油獨特風味的形成有重要作用[12]。

在醬油揮發性風味化合物研究中，2-苯乙醇作為一種常見香氣成分被檢出[5,13-14]，2-苯乙醇特有的玫瑰樣香氣對醬油風味的形成起重要作用[15]。酵母菌合成2-苯乙醇的代謝途徑主要有莽草酸途徑和艾氏途徑；莽草酸途徑是釀酒酵母從頭合成2-苯乙醇的代謝途徑，底物是糖酵解途徑的磷酸烯醇式丙酮酸和磷酸戊糖途徑的4-磷酸赤蘚糖；艾氏途徑是酵母以L-苯丙氨酸為前體，通過氨基轉移酶和脫羧酶合成2-苯乙醇[16]。吳雅男[17]研究發現魯氏酵母是醬油中2-苯乙醇等化合物代謝合成的關鍵微生物；馮杰[18]報道了1 株耐高鹽增香酵母菌埃切假絲酵母菌（Candida etchellsiiCICIM Y0600）在醬油發酵過程中可以合成2-苯乙醇。崔瑞迎等[19]發現耐鹽酵母菌（Zygosaccharomyces rouxiiCGMCC 3791）接種醬醪發酵，最終醬醪中的2-苯乙醇質量濃度顯著增加。目前對于醬油特征風味成分2-苯乙醇的研究主要集中在該成分的檢出[20-21]以及微生物添加引起的醬油風味成分（包含2-苯乙醇）變化[22-24]。對于以提升醬油2-苯乙醇含量為目的，對2-苯乙醇產生菌進行分離篩選和應用的報道較少。

本研究從發酵醪樣品中分離篩選到1 株產2-苯乙醇的酵母922-1，并采用生理生化測試和分子生物學方法對其進行鑒定。研究922-1在不同鹽度培養基中的生長情況，闡明922-1代謝2-苯乙醇的生化途徑。922-1添加醬醪發酵實驗顯示出922-1在提升醬油發酵醪中2-苯乙醇質量濃度，改善醬油香氣和口感方面具有廣闊應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油發酵醪樣品取自李錦記（新會）食品有限公司。

麥芽汁培養基：5%麥芽浸粉，1%酵母抽提物；醬醪發酵液培養基：取發酵2 周醬油發酵醪，200 目紗網過濾，過濾清液5 000 r/min離心10 min，上清液即為醬醪發酵培養基。

酵母篩選平板 廣東環凱微生物科技有限公司；生理生化實驗試劑、苯乙醇（色譜純） 生工生物工程（上海）股份有限公司；麥芽浸粉、瓊脂粉 北京陸橋技術股份有限公司；其他生化試劑均為分析純 廣州化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

7820A-5977B氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用分析系統（色譜柱DB-WA×U2（30 m×0.32 mm，0.25 μm）） 美國安捷倫公司；5732-U固相微萃取小柱（50/30 μm，DVB/CAR/PDMS） 美國色譜科公司。

1.3 方法

1.3.1 產香酵母的分離

取不同發酵階段的醬油發酵醪，生理鹽水梯度稀釋后涂布酵母篩選平板，30 ℃靜置培養72 h，挑取單菌落進行進一步劃線分離純化。純化后菌株接種麥芽汁培養基，30 ℃、150 r/min振蕩培養96 h，進行香氣鑒評，將具有獨特花香發酵液對應的酵母菌株命名為922-1。

1.3.2 產香酵母922-1風味成分分析

挑取922-1單菌落接種于麥芽汁培養基，30 ℃、200 r/min振蕩培養48 h，得到922-1種子培養液。將種子培養液按5%接種到醬醪發酵液培養基，30 ℃、100 r/min振蕩培養14 d，發酵液頂空固相微萃取（solidphase microextraction，SPME）樣品進行GC-MS分析，具體方法如下：

取2 mL樣品于4 mL樣品瓶，采用固相微萃取小柱頂空萃取30 min，然后立即進樣進行GC-MS分析。氣相色譜載氣為氦氣，流速1.0 mL/min，固相微萃取小柱進樣時間為2 min，不分流，吹掃流量15 mL/min，吹掃2 min，色譜柱升溫程序為：40 ℃保持5 min；以2 ℃/min升溫到150 ℃，保留0 min；再以5 ℃/min升溫到240 ℃，保留10 min。質譜采用電子電離方式，電離能為70 eV，檢測器電壓為857 V，掃描范圍為m/z20～350，掃描速率為2.00 scans/s；進樣口和離子源溫度分別為250 ℃和230 ℃。

1.3.3 生理生化實驗

參考《酵母菌的特征與鑒定手冊》[25]對922-1進行生理生化實驗。

1.3.4 轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）序列聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增與系統進化樹構建

自菌株9 2 2-1基因組P C R擴增r D N A-I T S序列。3 0 μ L P C R體系：2 0 n g D N A模板（菌株9 2 2-1基因組），2 5 p m o l通用引物（I T S 1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），100 μmol/L dNTP，1 mmol/L MgCl2和2.5 U HiFi DNA聚合酶，PCR產物由華大基因測序。通過BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫獲得來源于不同菌株的ITS rDNA同源序列，采用Clustal X[26]對上述序列進行多重序列比對，比對結果用MEGA 4軟件，采用鄰接法構建系統進化樹[27-28]。

1.3.5 922-1耐鹽性實驗

挑取922-1單菌落接種于麥芽汁培養基，30 ℃、200 r/min振蕩培養48 h，得到922-1種子培養液。將種子培養液按5%分別接種含0%、5%、10%、14%、16%、18% NaCl的麥芽汁培養基，30 ℃、200 r/min振蕩培養，按一定時間間隔取培養液在600 nm波長處測定OD值。

1.3.6 922-1添加不同培養基發酵實驗

挑取922-1單菌落接種于麥芽汁培養基，30 ℃、200 r/min振蕩培養48 h，得到922-1種子培養液。取200 mL種子培養液4 000 r/min離心8 min，菌體沉淀采用0.85%生理鹽水洗滌3 遍，再用0.85%生理鹽水重懸，并定容到200 mL。種子懸液按5%分別接種到兩組培養基，對照組不接種。第1組包括以苯丙氨酸為唯一氮源、以硫酸銨為唯一氮源、麥芽汁培養基、麥芽汁培養基添加苯丙氨酸4 種培養基；第2組包括醬油發酵醪、醬油發酵醪加苯丙氨酸2 種培養基。30 ℃、200 r/min振蕩培養24 h，將轉速降為80 r/min，繼續培養28 d。取5 mL培養液，加入30 mL乙醚，萃取3 次；收集上層萃取液真空濃縮，并溶于無水乙醇，根據濃度合理稀釋并用GC-MS進行定量分析。GC-MS具體操作方法如下：

氣相色譜載氣為氦氣，流速1.0 mL/min，進樣量1.0 μL，分流比為10∶1，色譜柱升溫程序為：60 ℃，保留1 min；以8 ℃/min升溫到220 ℃，保留0 min；再以4 ℃/min升溫到250 ℃，保留2 min。質譜采用電子電離方式，電離能為70 eV，檢測器電壓為857 V，掃描范圍為m/z50～400，掃描速率為2.00 scans/s；進樣口和離子源溫度分別為250 ℃和230 ℃。采用SIM模式，以m/z91.1和122.0兩個離子為定量離子進行分析。2-苯乙醇標準曲線方法為：取色譜純苯乙醇梯度稀釋到質量濃度10、20、50、80、100 mg/L，采用上述色譜和質譜條件檢測不同質量濃度苯乙醇的定量離子峰面積，線性回歸得到標準曲線方程為：y=4.514×104x-1.312×105（R2=0.999 59）。進而以標準曲線計算樣品中2-苯乙醇含量。

1.3.7 感官評價

由10 位在醬油風味鑒評方面具有豐富經驗的技術人員，對不同生醬油樣品進行盲評。香氣方面分別從酸味、豆香、麥芽香、焦香、醇香、綜合香氣6 個維度對樣品進行評分；口感方面分別從咸味、鮮味、苦味、甜味、酸味、厚味、綜合口感7 個維度對樣品進行評分。取各維度評分的平均數，用Microsoft Office Excel繪制雷達圖。

1.4 數據及圖像處理

GC-MS總離子流圖為GC-MS數據處理軟件導出，并將主要檢出峰的鑒定結果標注在離子流圖上。耐鹽性分析實驗及苯乙醇測定均設置3 個平行樣，結果顯示為。耐鹽性分析結果采用OriginPro 8進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 產香酵母922-1風味成分鑒定結果

醬油發酵液接種922-1種子培養液連續發酵28 d，采用SPME-GC-MS對揮發性風味成分進行檢測，結果如圖1所示。實驗組揮發性成分中醇類物質種類和含量相對對照組明顯增加，特別是乙醇、異戊醇、2-苯乙醇增加顯著，其中2-苯乙醇增幅最大（表1）；小分子有機酸醋酸和異丁酸的含量也明顯增加。表明在有氧的情況下922-1可在醬油發酵醪中代謝產生醇類物質和少量有機酸，2-苯乙醇是其主要代謝產物。

圖1 產香酵母922-1風味成分GC-MS分析Fig. 1 Analysis of fl avor components from 922-1 by GC-MS

表1 產香酵母922-1揮發性風味成分相對定量分析Table 1 Relative quantitative analysis of volatile fl avor compounds from 922-1

2.2 產香酵母922-1形態特征

圖2 產香酵母922-1菌落形態（A）與菌體形態（B）Fig. 2 Colonial morphology (A) and thallus morphology (B) of 922-1

如圖2A所示，產香酵母922-1在麥芽汁平板上菌落淺黃色，奶酪狀，邊緣光滑，微隆起。顯微鏡觀察發現922-1菌體具有橢球狀和絲狀兩種存在狀態，大部分以絲狀存在，并可見明顯分枝（圖2B）。根據922-1菌落特征和菌絲狀態推測其為假絲酵母屬微生物。

2.3 產香酵母922-1生理生化鑒定

如表2所示，922-1發酵葡萄糖、半乳糖和木糖的能力較弱，不能發酵麥芽糖、阿拉伯糖等糖類物質，與已報道Candida oceaniMo39[29]糖發酵測試結果相似。922-1同化糖類物質的能力較強，除乳糖和淀粉外，其可以同化已測試全部糖類；C. oceaniMo39不能同化蜜三糖，其他測試結果與922-1相同。922-1與C. oceaniMo39均不能同化肌醇、DL-乳酸，但均可以同化赤蘚醇、甘露醇、山梨醇、甘油、乙醇、檸檬酸鹽和水楊苷。922-1可同化琥珀酸鹽，微弱同化葡萄糖酸鹽，但C. oceaniMo39同化琥珀酸鹽的能力較弱，不能同化葡萄糖酸鹽。922-1可以同化硝酸鈉，脲酶測試為陽性，可在18%氯化鈉中增殖，50%葡萄糖中增殖緩慢，1%乙酸測試為陰性；C. oceaniMo39脲酶測試為陰性。上述測試結果表明，922-1與C. oceaniMo39的生理生化特性具有較大的相似性。

表2 產香酵母922-1生理生化測試結果Table 2 Physiological and biochemical identi fi cation of 922-1

2.4 產香酵母922-1的ITS rDNA序列PCR擴增與系統進化樹構建

圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測922-1 ITS rDNA序列PCR產物Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of PCR products of ITS rDNA sequence from 922-1

為進一步鑒定922-1的分類學地位，對其ITS rDNA序列進行克隆，PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3所示，顯示其片段長度約750 bp。DNA測序結果表明PCR擴增到的ITS rDNA序列長度為665 bp。該序列提交GenBank（登錄號：MH493725）并進行BLAST分析，選取同源序列進行系統進化樹構建，結果顯示922-1與C. oceani聚為一支，表明其與C. oceani親緣關系較近。Burgaud等[29]在研究大西洋深海微生物C. oceani時發現了相似規律。綜合形態學觀察、生理生化測試和分子生物學鑒定，初步確定922-1為C. oceani。

2.5 C. oceani 922-1耐鹽性分析

如圖4所示，NaCl質量分數對C. oceani922-1生長曲線影響顯著，隨著NaCl質量分數的升高，C. oceani922-1穩定期細胞濃度降低，NaCl質量分數超過14%時，生長延遲期明顯延長，NaCl質量分數為18%時，延遲期達到30 h。說明C. oceani922-1具有一定的耐鹽性，可以在高含鹽發酵食品（18% NaCl）中生長，但細胞增殖速率受到一定程度抑制，穩定期細胞濃度顯著降低。

圖4 C. oceani922-1在不同質量分數NaCl中生長曲線分析Fig. 4 Growth curves of C. oceani 922-1 at various NaCl concentrations

2.6 C. oceani 922-1在不同培養基中2-苯乙醇代謝能力分析

表3 C. oceani 922-1在不同培養基中2-苯乙醇合成質量濃度Table 3 Production of 2-phenethyl alcohol by C. oceani 922-1 in various media

如表3所示，C. oceani922-1可利用苯丙氨酸作為唯一氮源代謝合成2-苯乙醇，2-苯乙醇質量濃度達到968.60 mg/L；而以硫酸銨為唯一氮源的培養基中2-苯乙醇質量濃度僅為4.07 mg/L，這一結果表明C. oceani922-1主要通過艾氏途徑，利用苯丙氨酸作為底物合成2-苯乙醇[16]；在麥芽汁培養基上得到了相似的結果。在不加苯丙氨酸的情況下，C. oceani922-1可以在硫酸銨為唯一氮源的培養基中少量合成2-苯乙醇（4.07 mg/L），說明其同時可以通過草莽酸途徑合成2-苯乙醇。在不加苯丙氨酸的情況下，C. oceani922-1在麥芽汁培養基中合成2-苯乙醇質量濃度為85.60 mg/L，說明C. oceani922-1艾氏途徑代謝所需酶蛋白為組成型表達。但是，在麥芽汁培養基加入苯丙氨酸實驗組2-苯乙醇質量濃度低于以苯丙氨酸為唯一氮源實驗組，推測C. oceani922-1在其他氮源存在的情況下，2-苯乙醇合成途徑受到一定的抑制。

2.7 C. oceani 922-1在醬油發酵中的應用

表4 C. oceani922-1添加對醬油發酵醪理化指標的影響Table 4 Effect of C. oceani922-1 on physicochemical indexes

表5 C. oceani922-1添加對醬油發酵醪2-苯乙醇含量的影響Table 5 Effect of C. oceani922-1 on content of 2-phenethyl alcohol

由于C. oceani922-1具有利用普通培養基代謝合成2-苯乙醇的能力，并能耐受18% NaCl，因此其具有在醬油發酵中應用的潛力。添加C. oceani922-1種子培養液進行醬油發酵實驗，理化指標測定結果如表4所示。發酵70 d后，實驗組總酸、氨基酸態氮、pH值和固形物含量情況與對照組相近，還原糖較對照組有一定幅度降低，推測其主要被C. oceani922-1代謝利用。C. oceani922-1添加醬油發酵醪發酵28 d，2-苯乙醇質量濃度為44.70 mg/L，較對照組提高了6 倍；添加苯丙氨酸后2-苯乙醇質量濃度進一步提高到109.9 mg/L（表5）。這一結果證實C. oceani922-1可以在醬油發酵醪中大量合成2-苯乙醇，苯丙氨酸的添加可以將醬油發酵醪中2-苯乙醇質量濃度進一步提高到對照組的17.3 倍。

如圖5所示。香氣鑒評表明，C. oceani922-1添加發酵可以提升醬油醇香，豆香、麥芽香和焦香差異不顯著；添加苯丙氨酸強化2-苯乙醇代謝后，豆香和焦香減弱，推測主要由2-苯乙醇香氣的掩蓋效應引起。口感方面，由于還原糖的消耗，C. oceani922-1添加發酵生醬油甜味有所降低、酸味減弱。一定程度提升了厚味，咸味、鮮味和苦味變化不顯著，綜合口感得分明顯提高，說明2-苯乙醇質量濃度的變化對味覺提升有一定的輔助作用。添加苯丙氨酸強化2-苯乙醇代謝后，厚味和綜合口感得分均有所降低，說明高質量濃度2-苯乙醇不利于醬油口感的改善。

提升和優化醬油風味是滿足消費者不斷升級的消費需求的重要手段。C. oceani922-1添加發酵提升醬油醇香，對于迎合消費者對醬油香氣濃郁、口感醇厚的需求有重要意義；也為特殊香型醬油的開發提供了新的思路。同時，C. oceani922-1在提升其他高鹽發酵調味品（如腐乳、豆豉、發酵醬等）的風味品質方面也有較大的應用前景。

圖5 C. oceani922-1添加對醬油發酵醪風味的影響Fig. 5 Effect of C. oceani 922-1 on fl avor of soy sauce

3 結 論

從醬油發酵醪中分離篩選到1 株可代謝合成2-苯乙醇的酵母，經形態學觀察、生理生化測試和分子生物學鑒定，初步確定為C. oceani。C. oceani922-1可以耐受18%NaCl；其主要通過艾氏途徑合成2-苯乙醇，在以苯丙氨酸為唯一氮源的培養基中2-苯乙醇代謝質量濃度可達968.60 mg/L，但在其他氮源存在的情況下，2-苯乙醇合成途徑受到一定的抑制。C. oceani922-1添加醬油發酵醪可一定程度降低發酵液還原糖含量，對其他理化指標影響不顯著。C. oceani922-1添加醬油發酵可使2-苯乙醇代謝量較對照組提高6倍，外加苯丙氨酸后2-苯乙醇含量進一步提高到對照組的17.3 倍。鑒評發現C. oceani922-1添加發酵生醬油醇香和厚味明顯改善，說明其在醬油等高鹽發酵調味品風味改善方面有較大的應用前景。