食品中甲型肝炎病毒RNA提 取方法的比較及應(yīng)用

馮華煒，閆平平，艾海新,3，李思嘉，麻麗丹，劉宏生,3,*

（1.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；2.大連出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116400；3.遼寧省生物大分子模擬計(jì)算與信息處理工程研究中心，遼寧 沈陽 110036；4.東港市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法大隊(duì)，遼寧 丹東 118000；5.丹東出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 丹東 118000）

甲型病毒性肝炎是由甲型肝炎病毒引起的急性腸道傳染病，呈世界范圍的分布，中國為高發(fā)區(qū)，其發(fā)病居各型肝炎之首[1]。在我國，甲型肝炎的流行不僅是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題，也是一個(gè)值得關(guān)注的社會(huì)問題[2-4]。1988年上海暴發(fā)的生食毛蚶引起的甲型病毒肝炎暴發(fā)流行事件[5-6]，2013年歐盟、日本等抽檢檢測中國食品中的甲肝病毒事件[7-9]，2015年于澳洲、新西蘭暴發(fā)的漿果中含甲肝病毒事件[10-11]，都為我國食品中甲肝病毒的安全檢測工作敲響了警鐘，開展食品中甲型肝炎病毒的檢測研究刻不容緩。

在食源性病毒的檢測中，病毒RNA的提取是一個(gè)關(guān)鍵步驟，所提取的RNA的質(zhì)量決定了能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的最大值，良好的RNA提取方法可以獲得無核糖核酸酶（RNA酶）污染的全長RNA，這對(duì)進(jìn)行復(fù)雜成分的食品基質(zhì)中的病毒的RNA提取十分關(guān)鍵。另外，食品中病毒核酸的量相對(duì)于食品樣品而言微乎其微，抽提出來的核酸主要為食品樣品或者抽提試劑加入的載體核酸，而采用A260nm/A280nm評(píng)估食源性病毒核酸抽提效果價(jià)值較小，因此采用靈敏度高，檢測動(dòng)態(tài)范圍廣的實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）用于食品中病毒核酸的抽提效果評(píng)估具有很好的應(yīng)用價(jià)值。早期，病毒RNA的提取主要采用Trizol法[12-13]、異硫氰酸胍法[14-15]等，這些傳統(tǒng)提取方法操作步驟繁瑣、易污染，且核酸提取效率較低。近年來市場上可供使用的RNA商業(yè)提取試劑盒日益增加，極大地簡化了核酸提取操作步驟，有效提高了核酸檢測靈敏度和提取效率，同時(shí)也給操作人員提供了多種選擇。針對(duì)這種情況，開展核酸提取試劑盒的提取效果評(píng)估工作，為使用者根據(jù)檢測樣本的實(shí)際情況和使用目的合理選擇核酸提取試劑盒提供幫助。目前，針對(duì)不同類型病毒的核酸抽提方法的比較評(píng)估已有許多研究，但是鮮有針對(duì)食源性甲型肝炎病毒核酸提取方法的比較研究[16-18]。因此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法對(duì)市售的比較權(quán)威的3 種商用RNA提取試劑盒在常見的水產(chǎn)品、果蔬類制品等食品中甲型肝炎病毒RNA的提取效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)與比較，為實(shí)驗(yàn)人員合理選擇RNA提取方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草莓50 份、樹莓10 份、黑莓10 份、鵝莓10 份、圓蔥10 份，文蛤10 份、藍(lán)靛果1 份均來自遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局丹東分局進(jìn)出口樣品及基地監(jiān)測樣品；貝類、圓蔥等樣品采購于遼寧丹東市農(nóng)業(yè)貿(mào)易市場。

ABI AgPath-IDTM One-step RT-PCR Kit（貨號(hào)：AM1005）、MagMAX?-96 Viral RNA Isolation Kit（貨號(hào)：AM1836）（簡稱ABI AM1836） 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit（貨號(hào)：74104）（簡稱QIAGEN 74104） 德國凱杰公司；High Pure Viral RNA isolation Kit（貨號(hào)：11858882001）（簡稱ROCHE 11858882001） 豪夫邁·羅氏公司；過程控制對(duì)照為甲型肝炎病毒減毒疫苗（滴定度106.5CCID50/mL）長春長生生物科技股份有限公司。

檢測甲型肝炎病毒的引物探針序列[19]見表1，由上海Invitrogen公司合成。

表1 HAV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測的引物及探針Table 1 Primers and probes used for RT-PCR ampli fi cation of HAV RNA

1.2 方法

1.2.1 人工污染樣本的制備

分別剪?。?0±0.1）g已知甲型肝炎病毒陰性的草莓、樹莓、黑莓、圓蔥樣品和（2±0.1）g已知甲型肝炎病毒陰性的貝類樣品于離心管中，每種樣品各20 份，每份加入10 μL的甲型肝炎病毒減毒疫苗，室溫靜置20 min，使病毒充分吸附于食品樣品中[19-20]。

1.2.2 食品樣品中病毒的富集

按照ISO方法[19]中關(guān)于軟質(zhì)水果、沙拉蔬菜、貝類等食品樣品的病毒富集方法進(jìn)行人工污染食品樣品的病毒富集。

1.2.3 病毒RNA提取方法比較

1.2.3.1 核酸提取效率的評(píng)價(jià)

對(duì)人工污染樣品進(jìn)行病毒富集后，分別采用ABI AM1836、QIAGEN 74104和ROCHE 11858882001三種甲型肝炎病毒試劑盒進(jìn)行草莓、樹莓、黑莓、貝類、圓蔥5 種食品中的甲型肝炎病毒RNA的提取，每個(gè)樣品做兩個(gè)平行，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的Ct值對(duì)3 種核酸提取試劑盒的提取效率進(jìn)行比較。

1.2.3.2 抽提核酸穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)

將同一食品樣品中提取的甲型肝炎病毒核酸分成兩份，一份于室溫（20～25 ℃）放置24 h，另一份按照核酸保存方法于-20 ℃放置，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的擴(kuò)增Ct值評(píng)價(jià)3 種核酸提取試劑盒的核酸抽提穩(wěn)定性。

1.2.3.3 抑制劑去除效率的評(píng)價(jià)

每份樣品中取10 μL甲型肝炎病毒RNA原液進(jìn)行10 倍稀釋，同時(shí)與未稀釋的核酸一起進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增。10 倍稀釋RNA的Ct值與原倍RNA的Ct值之差大約為 3.3，如差值小于3.3甚至負(fù)數(shù)（稀釋的樣品擴(kuò)增曲線反而在前面），則說明該核酸提取試劑盒對(duì)食品中甲型肝炎病毒的抑制劑去除的效果較差。

1.2.3.4 檢測靈敏度的評(píng)價(jià)

將甲型肝炎病毒減毒疫苗分別進(jìn)行2×10-2、2×10-3、2×10-4和2×10-5稀釋，按照1.2.2節(jié)中的方法分別制備貝類和樹莓人工污染樣品，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行，采用3 種核酸試劑盒進(jìn)行病毒富集液中病毒RNA的提取，采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR確定每種核酸提取方法的檢測靈敏度。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR

甲型肝炎病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR體系包括：1×RT-PCR酶預(yù)混液1 μL、2×RT-PCR緩沖液12.5 μL、甲型肝炎病毒正向引物0.625 μL（20 μmol/L）、甲型肝炎病毒反向引物1.125 μL（20 μmol/L）、甲型肝炎病毒熒光探針0.312 5 μL（20 μmol/L）、RNA模板5 μL，補(bǔ)充水至25 μL；反應(yīng)參數(shù)參照試劑盒說明書。

1.2.5 實(shí)際樣品檢測

采用優(yōu)化后的核酸提取方法，對(duì)送檢的101 份食品樣品進(jìn)行病毒RNA的提取，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照和過程控制對(duì)照，以驗(yàn)證該提取方法對(duì)實(shí)際樣品的檢測能力。

1.3 數(shù)據(jù)分析

制圖采用GraphPad Prism 6，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取效率的比較

3 種核酸提取試劑盒對(duì)草莓、樹莓、黑莓、貝類、圓蔥等樣品中甲型肝炎病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，不同核酸提取方法在不同樣品中的提取效率差異顯著（P＜0.05）。其中ROCHE 11858882001的Ct值最高，其次為QIAGEN 74104和ABI AM1836（圖1）。

圖1 3 種核酸提取食品樣品中甲型肝炎病毒RNA提取效率比較Fig. 1 Extraction efficiencies of RNA from HAV in different food samples with different extraction kits

2.2 抽提核酸的穩(wěn)定性

圖2 3 種核酸提取方法提取甲型肝炎病毒RNA的穩(wěn)定性Fig. 2 Stability of three extraction kits

如圖2所示，3 種試劑盒提取的甲型肝炎病毒RNA的Ct值在室溫和-20 ℃條件下差異顯著（P＜0.05），表明3 種核酸提取方法均具有良好的核酸抽提穩(wěn)定性。

2.3 抑制劑去除效率測定結(jié)果

3 種核酸抽提試劑盒對(duì)草莓、樹莓、黑莓、貝類和圓蔥樣品中甲型肝炎病毒的抑制劑去除效率結(jié)果見表2，其中QIAGEN 74104的病毒RNA原倍與10 倍稀釋Ct值差值為3.133，ABI AM1836的病毒RNA原倍與10 倍稀釋Ct值差值為2.996，ROCHE 11858882001的病毒RNA原倍與10 倍稀釋Ct值差值為3.225，且差異顯著（F值：21.991、18.660、26.802、22.888、21.349，P＜0.05），表明ROCHE 11858882001具有較好的抑制劑去除效率（更接近于3.3）。

表2 3 種核酸提取方法對(duì)食品樣品中甲型肝炎病毒RNA的抑制劑去除效果Table 2 Effect of three extraction kits on removal of HAV RNA inhibitors from food samples

2.4 檢測靈敏度結(jié)果

采用3 種核酸提取方法對(duì)軟質(zhì)蔬菜水果和貝類樣品中具有代表性的樹莓和貝類樣品的檢測靈敏度結(jié)果顯示（表3），3 種核酸提取試劑盒在貝類樣品中的檢測靈敏度分別為6.32（ROCHE 11858882001）、63.2（ABI AM1836）、63.2 CCID50/2 g（QIAGEN 74104）；3 種核酸提取試劑盒在樹莓樣品中的檢測靈敏度分別為0.63（ROCHE 11858882001）、6.32（ABI AM1836）、6.32 CCID50/20 g（QIAGEN 74104）。結(jié)果表明，ROCHE 11858882001的檢測靈敏度最高。

表3 3 種核酸提取方法對(duì)食品樣品中HAV RNA的檢測靈敏度結(jié)果Table 3 Sensitivity of three RNA extraction kits for HAV detection in food samples

2.5 提取方法綜合比較

3 種RNA提取方法中，QIAGEN 74104和ROCHE 11858882001均為手動(dòng)提取，提取24 份樣品需要2 h左右，ABI AM1836為封閉狀態(tài)自動(dòng)化提取，提取時(shí)間最短；ABI AM1836可提取次數(shù)最多，其次為ROCHE 11858882001和QIAGEN 74104；QIAGEN 74104在RNA提取時(shí)所需病毒懸液的量最大，其次為ROCHE 11858882001；而在實(shí)驗(yàn)成本方面，ROCHE 11858882001的成本最低，其次為QIAGEN 74104和ABI AM1836。因此，本實(shí)驗(yàn)選取的最優(yōu)方法為ROCHE 11858882001（表4）。

表4 3 種核酸提取方法進(jìn)行RNA提取的綜合應(yīng)用結(jié)果Table 4 Comparison of three RNA extraction kits

2.6 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

采用優(yōu)化好的RNA提取方法對(duì)送檢的101 份食品樣品的檢測結(jié)果（圖3）顯示，一份藍(lán)靛果樣品為甲型肝炎病毒核酸陽性（平均Ct值為29.50），其余樣品為甲型肝炎病毒陰性，過程控制對(duì)照（平均Ct值為23.67）、PCR陽性對(duì)照（平均Ct值為18.97）和陰性對(duì)照（無典型擴(kuò)增曲線）均為正常。對(duì)藍(lán)靛果樣品中的陽性病毒RNA進(jìn)行克隆測序后，基因比對(duì)結(jié)果進(jìn)一步確證該病毒為甲型肝炎病毒。研究結(jié)果證明本研究中優(yōu)化的核酸提取方法適用于食品樣品中甲型肝炎病毒RNA的提取和檢測。

圖3 藍(lán)靛果樣品中檢出甲型肝炎病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 3 Real-time fl uorescence RT-PCR detection of HAV in blue honeysuckle sample

3 討 論

甲型肝炎病毒為引起食源性疾病的重要病原之一，但是該病毒在食品樣品中的檢測方法仍未成熟。在甲型肝炎病毒暴發(fā)的許多案例中，對(duì)可疑的食物確認(rèn)成為了最大的難點(diǎn)，原因?yàn)椋?）食品中甲型肝炎病毒含量較低；2）甲肝病毒培養(yǎng)周期較長，難以實(shí)現(xiàn)快速檢測；3）從食品基質(zhì)中純化病毒遺傳物質(zhì)的方法效率較低；4）食品基質(zhì)中含有大量干擾物質(zhì)。因此，高特異性和靈敏度的PCR技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于漿果、蔬菜、水果、貝類等食品基質(zhì)中甲型肝炎病毒的檢測研究中[21-24]?，F(xiàn)有的分子診斷方法中，病毒RNA提取是分子生物學(xué)檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，RNA的提取效率和質(zhì)量直接影響最終檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[23,25]。因此，選擇一種高效的RNA提取方法，對(duì)食品中甲型肝炎病毒的核酸進(jìn)行檢測至關(guān)重要。目前，市售的核酸提取試劑盒主要采用膜吸附、紙片法、磁珠吸附等技術(shù)進(jìn)行RNA提取，這些試劑盒在檢測時(shí)限、檢測準(zhǔn)確性、核酸提取效率等方面存在巨大差異[23,25]。對(duì)病毒核酸提取方法比較研究方面，呂艷等[25]對(duì)新城疫病毒的5種核酸提取方法的提取效率進(jìn)行了比較研究。王赤華等[26]僅對(duì)甲型H1N1流感病毒的3 種核酸提取方法進(jìn)行提取率的比較，而鮮有針對(duì)這些病毒核酸提取試劑盒進(jìn)行全面的分析比較研究的報(bào)道[22,27]。此外，對(duì)于食源性病毒檢測工作者來說，花費(fèi)大量的時(shí)間和精力在眾多的商品化核酸提取試劑盒中選擇一種檢測效率高的試劑盒嚴(yán)重影響工作效率，也降低了實(shí)驗(yàn)室檢測準(zhǔn)確性，增加了檢測風(fēng)險(xiǎn)。本研究采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)檢測甲型肝炎病毒的RNA，通過PCR擴(kuò)增Ct值對(duì)3 種常用的商用病毒RNA提取試劑盒的提取效率、核酸抽提穩(wěn)定性、抑制劑去除效率、檢測靈敏度、綜合應(yīng)用等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，以找到食品中甲型肝炎病毒RNA的最佳提取方法。

本研究發(fā)現(xiàn)，在提取效率方面，ROCHE試劑盒要明顯優(yōu)于其他兩種試劑盒；在核酸抽提穩(wěn)定性方面，3 種核酸提取試劑盒均有良好的核酸抽提穩(wěn)定性；在抑制劑去除效率方面，3 種核酸提取試劑盒提取對(duì)于甲型肝炎病毒抑制劑的去除差異顯著，其中ROCHE 11858882001＞QIAGEN 74104＞ABI AM1836；在檢測靈敏度方面，饒紅等[28-29]對(duì)蔬菜、水果、貝類中甲型肝炎病毒進(jìn)行檢測研究，其中蔬菜中甲型肝炎的檢測靈敏度為30 TCID50/1.5 g，草莓中甲型肝炎的檢測靈敏度為48 TCID50/100 g，貝類中甲型肝炎的檢測靈敏度為10 TCID50/100 g。在本研究中，采用ROCHE 11858882001對(duì)貝類和樹莓樣品中的甲型肝炎病毒進(jìn)行檢測，檢測靈敏分別為6.32 CCID50/2 g和0.63 CCID50/20 g，檢測靈敏度均優(yōu)于報(bào)道方法。此外，在病毒RNA提取過程中，所取的病毒懸浮液量過大，會(huì)使提取液中殘留的抑制劑濃度過高，從而降低了病毒的檢測靈敏度，而取樣量過少，懸浮液中病毒含量過低也會(huì)降低病毒的檢測靈敏度[30]，本研究中，ABI AM1836提取所需病毒懸液僅為50 μL，這可能是ABI AM1836檢測效果較差的原因。在本研究中，ROCHE 11858882001具有較好的提取效果，表明在食源性甲型肝炎病毒檢測中，RNA提取的試樣量為200 μL就已經(jīng)足夠了。而綜合操作時(shí)間及成本等因素，ROCHE 11858882001具有良好的使用價(jià)值。

目前，從貝類樣品檢出甲型肝炎病毒的報(bào)道較多，而從草莓、樹莓、蘋果等水果蔬菜中檢出甲型肝炎病毒報(bào)道較少。莫雪梅等[31]從45 份草莓樣品檢出3 份甲型肝炎病毒陽性樣品。房保海等[21]從216 個(gè)果蔬樣品種冷凍草莓、冷凍藍(lán)莓、冷凍土豆丁、冷凍蘋果丁和冷凍樹莓檢出了6 個(gè)甲型肝炎病毒陽性樣品。Li Dan等[32]從2 015 個(gè)漿果樣品中檢出草莓和紅加侖2 個(gè)甲型肝炎病毒陽性樣本。而本研究采用優(yōu)化好的RNA提取方法實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，于一份藍(lán)靛果樣品中檢出甲型肝炎病毒，對(duì)于研究小漿果中甲型肝炎病毒檢測方法具有重要意義。