食品中甲型肝炎病毒RNA提 取方法的比較及應(yīng)用

馮華煒，閆平平，艾海新,3，李思嘉，麻麗丹，劉宏生,3,*

（1.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；2.大連出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116400；3.遼寧省生物大分子模擬計(jì)算與信息處理工程研究中心，遼寧 沈陽(yáng) 110036；4.東港市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法大隊(duì)，遼寧 丹東 118000；5.丹東出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 丹東 118000）

甲型病毒性肝炎是由甲型肝炎病毒引起的急性腸道傳染病，呈世界范圍的分布，中國(guó)為高發(fā)區(qū)，其發(fā)病居各型肝炎之首[1]。在我國(guó)，甲型肝炎的流行不僅是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，也是一個(gè)值得關(guān)注的社會(huì)問(wèn)題[2-4]。1988年上海暴發(fā)的生食毛蚶引起的甲型病毒肝炎暴發(fā)流行事件[5-6]，2013年歐盟、日本等抽檢檢測(cè)中國(guó)食品中的甲肝病毒事件[7-9]，2015年于澳洲、新西蘭暴發(fā)的漿果中含甲肝病毒事件[10-11]，都為我國(guó)食品中甲肝病毒的安全檢測(cè)工作敲響了警鐘，開(kāi)展食品中甲型肝炎病毒的檢測(cè)研究刻不容緩。

在食源性病毒的檢測(cè)中，病毒RNA的提取是一個(gè)關(guān)鍵步驟，所提取的RNA的質(zhì)量決定了能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的最大值，良好的RNA提取方法可以獲得無(wú)核糖核酸酶（RNA酶）污染的全長(zhǎng)RNA，這對(duì)進(jìn)行復(fù)雜成分的食品基質(zhì)中的病毒的RNA提取十分關(guān)鍵。另外，食品中病毒核酸的量相對(duì)于食品樣品而言微乎其微，抽提出來(lái)的核酸主要為食品樣品或者抽提試劑加入的載體核酸，而采用A260nm/A280nm評(píng)估食源性病毒核酸抽提效果價(jià)值較小，因此采用靈敏度高，檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍廣的實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）用于食品中病毒核酸的抽提效果評(píng)估具有很好的應(yīng)用價(jià)值。早期，病毒RNA的提取主要采用Trizol法[12-13]、異硫氰酸胍法[14-15]等，這些傳統(tǒng)提取方法操作步驟繁瑣、易污染，且核酸提取效率較低。近年來(lái)市場(chǎng)上可供使用的RNA商業(yè)提取試劑盒日益增加，極大地簡(jiǎn)化了核酸提取操作步驟，有效提高了核酸檢測(cè)靈敏度和提取效率，同時(shí)也給操作人員提供了多種選擇。針對(duì)這種情況，開(kāi)展核酸提取試劑盒的提取效果評(píng)估工作，為使用者根據(jù)檢測(cè)樣本的實(shí)際情況和使用目的合理選擇核酸提取試劑盒提供幫助。目前，針對(duì)不同類型病毒的核酸抽提方法的比較評(píng)估已有許多研究，但是鮮有針對(duì)食源性甲型肝炎病毒核酸提取方法的比較研究[16-18]。因此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法對(duì)市售的比較權(quán)威的3 種商用RNA提取試劑盒在常見(jiàn)的水產(chǎn)品、果蔬類制品等食品中甲型肝炎病毒RNA的提取效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)與比較，為實(shí)驗(yàn)人員合理選擇RNA提取方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草莓50 份、樹(shù)莓10 份、黑莓10 份、鵝莓10 份、圓蔥10 份，文蛤10 份、藍(lán)靛果1 份均來(lái)自遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局丹東分局進(jìn)出口樣品及基地監(jiān)測(cè)樣品；貝類、圓蔥等樣品采購(gòu)于遼寧丹東市農(nóng)業(yè)貿(mào)易市場(chǎng)。

ABI AgPath-IDTM One-step RT-PCR Kit（貨號(hào)：AM1005）、MagMAX?-96 Viral RNA Isolation Kit（貨號(hào)：AM1836）（簡(jiǎn)稱ABI AM1836） 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit（貨號(hào)：74104）（簡(jiǎn)稱QIAGEN 74104） 德國(guó)凱杰公司；High Pure Viral RNA isolation Kit（貨號(hào)：11858882001）（簡(jiǎn)稱ROCHE 11858882001） 豪夫邁·羅氏公司；過(guò)程控制對(duì)照為甲型肝炎病毒減毒疫苗（滴定度106.5CCID50/mL）長(zhǎng)春長(zhǎng)生生物科技股份有限公司。

檢測(cè)甲型肝炎病毒的引物探針序列[19]見(jiàn)表1，由上海Invitrogen公司合成。

表1 HAV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的引物及探針Table 1 Primers and probes used for RT-PCR ampli fi cation of HAV RNA

1.2 方法

1.2.1 人工污染樣本的制備

分別剪取（20±0.1）g已知甲型肝炎病毒陰性的草莓、樹(shù)莓、黑莓、圓蔥樣品和（2±0.1）g已知甲型肝炎病毒陰性的貝類樣品于離心管中，每種樣品各20 份，每份加入10 μL的甲型肝炎病毒減毒疫苗，室溫靜置20 min，使病毒充分吸附于食品樣品中[19-20]。

1.2.2 食品樣品中病毒的富集

按照ISO方法[19]中關(guān)于軟質(zhì)水果、沙拉蔬菜、貝類等食品樣品的病毒富集方法進(jìn)行人工污染食品樣品的病毒富集。

1.2.3 病毒RNA提取方法比較

1.2.3.1 核酸提取效率的評(píng)價(jià)

對(duì)人工污染樣品進(jìn)行病毒富集后，分別采用ABI AM1836、QIAGEN 74104和ROCHE 11858882001三種甲型肝炎病毒試劑盒進(jìn)行草莓、樹(shù)莓、黑莓、貝類、圓蔥5 種食品中的甲型肝炎病毒RNA的提取，每個(gè)樣品做兩個(gè)平行，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的Ct值對(duì)3 種核酸提取試劑盒的提取效率進(jìn)行比較。

1.2.3.2 抽提核酸穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)

將同一食品樣品中提取的甲型肝炎病毒核酸分成兩份，一份于室溫（20～25 ℃）放置24 h，另一份按照核酸保存方法于-20 ℃放置，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的擴(kuò)增Ct值評(píng)價(jià)3 種核酸提取試劑盒的核酸抽提穩(wěn)定性。

1.2.3.3 抑制劑去除效率的評(píng)價(jià)

每份樣品中取10 μL甲型肝炎病毒RNA原液進(jìn)行10 倍稀釋，同時(shí)與未稀釋的核酸一起進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增。10 倍稀釋RNA的Ct值與原倍RNA的Ct值之差大約為 3.3，如差值小于3.3甚至負(fù)數(shù)（稀釋的樣品擴(kuò)增曲線反而在前面），則說(shuō)明該核酸提取試劑盒對(duì)食品中甲型肝炎病毒的抑制劑去除的效果較差。

1.2.3.4 檢測(cè)靈敏度的評(píng)價(jià)

將甲型肝炎病毒減毒疫苗分別進(jìn)行2×10-2、2×10-3、2×10-4和2×10-5稀釋，按照1.2.2節(jié)中的方法分別制備貝類和樹(shù)莓人工污染樣品，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行，采用3 種核酸試劑盒進(jìn)行病毒富集液中病毒RNA的提取，采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR確定每種核酸提取方法的檢測(cè)靈敏度。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR

甲型肝炎病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR體系包括：1×RT-PCR酶預(yù)混液1 μL、2×RT-PCR緩沖液12.5 μL、甲型肝炎病毒正向引物0.625 μL（20 μmol/L）、甲型肝炎病毒反向引物1.125 μL（20 μmol/L）、甲型肝炎病毒熒光探針0.312 5 μL（20 μmol/L）、RNA模板5 μL，補(bǔ)充水至25 μL；反應(yīng)參數(shù)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用優(yōu)化后的核酸提取方法，對(duì)送檢的101 份食品樣品進(jìn)行病毒RNA的提取，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照和過(guò)程控制對(duì)照，以驗(yàn)證該提取方法對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)能力。

1.3 數(shù)據(jù)分析

制圖采用GraphPad Prism 6，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取效率的比較

3 種核酸提取試劑盒對(duì)草莓、樹(shù)莓、黑莓、貝類、圓蔥等樣品中甲型肝炎病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，不同核酸提取方法在不同樣品中的提取效率差異顯著（P＜0.05）。其中ROCHE 11858882001的Ct值最高，其次為QIAGEN 74104和ABI AM1836（圖1）。

圖1 3 種核酸提取食品樣品中甲型肝炎病毒RNA提取效率比較Fig. 1 Extraction efficiencies of RNA from HAV in different food samples with different extraction kits

2.2 抽提核酸的穩(wěn)定性

圖2 3 種核酸提取方法提取甲型肝炎病毒RNA的穩(wěn)定性Fig. 2 Stability of three extraction kits

如圖2所示，3 種試劑盒提取的甲型肝炎病毒RNA的Ct值在室溫和-20 ℃條件下差異顯著（P＜0.05），表明3 種核酸提取方法均具有良好的核酸抽提穩(wěn)定性。

2.3 抑制劑去除效率測(cè)定結(jié)果

3 種核酸抽提試劑盒對(duì)草莓、樹(shù)莓、黑莓、貝類和圓蔥樣品中甲型肝炎病毒的抑制劑去除效率結(jié)果見(jiàn)表2，其中QIAGEN 74104的病毒RNA原倍與10 倍稀釋Ct值差值為3.133，ABI AM1836的病毒RNA原倍與10 倍稀釋Ct值差值為2.996，ROCHE 11858882001的病毒RNA原倍與10 倍稀釋Ct值差值為3.225，且差異顯著（F值：21.991、18.660、26.802、22.888、21.349，P＜0.05），表明ROCHE 11858882001具有較好的抑制劑去除效率（更接近于3.3）。

表2 3 種核酸提取方法對(duì)食品樣品中甲型肝炎病毒RNA的抑制劑去除效果Table 2 Effect of three extraction kits on removal of HAV RNA inhibitors from food samples

2.4 檢測(cè)靈敏度結(jié)果

采用3 種核酸提取方法對(duì)軟質(zhì)蔬菜水果和貝類樣品中具有代表性的樹(shù)莓和貝類樣品的檢測(cè)靈敏度結(jié)果顯示（表3），3 種核酸提取試劑盒在貝類樣品中的檢測(cè)靈敏度分別為6.32（ROCHE 11858882001）、63.2（ABI AM1836）、63.2 CCID50/2 g（QIAGEN 74104）；3 種核酸提取試劑盒在樹(shù)莓樣品中的檢測(cè)靈敏度分別為0.63（ROCHE 11858882001）、6.32（ABI AM1836）、6.32 CCID50/20 g（QIAGEN 74104）。結(jié)果表明，ROCHE 11858882001的檢測(cè)靈敏度最高。

表3 3 種核酸提取方法對(duì)食品樣品中HAV RNA的檢測(cè)靈敏度結(jié)果Table 3 Sensitivity of three RNA extraction kits for HAV detection in food samples

2.5 提取方法綜合比較

3 種RNA提取方法中，QIAGEN 74104和ROCHE 11858882001均為手動(dòng)提取，提取24 份樣品需要2 h左右，ABI AM1836為封閉狀態(tài)自動(dòng)化提取，提取時(shí)間最短；ABI AM1836可提取次數(shù)最多，其次為ROCHE 11858882001和QIAGEN 74104；QIAGEN 74104在RNA提取時(shí)所需病毒懸液的量最大，其次為ROCHE 11858882001；而在實(shí)驗(yàn)成本方面，ROCHE 11858882001的成本最低，其次為QIAGEN 74104和ABI AM1836。因此，本實(shí)驗(yàn)選取的最優(yōu)方法為ROCHE 11858882001（表4）。

表4 3 種核酸提取方法進(jìn)行RNA提取的綜合應(yīng)用結(jié)果Table 4 Comparison of three RNA extraction kits

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

采用優(yōu)化好的RNA提取方法對(duì)送檢的101 份食品樣品的檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，一份藍(lán)靛果樣品為甲型肝炎病毒核酸陽(yáng)性（平均Ct值為29.50），其余樣品為甲型肝炎病毒陰性，過(guò)程控制對(duì)照（平均Ct值為23.67）、PCR陽(yáng)性對(duì)照（平均Ct值為18.97）和陰性對(duì)照（無(wú)典型擴(kuò)增曲線）均為正常。對(duì)藍(lán)靛果樣品中的陽(yáng)性病毒RNA進(jìn)行克隆測(cè)序后，基因比對(duì)結(jié)果進(jìn)一步確證該病毒為甲型肝炎病毒。研究結(jié)果證明本研究中優(yōu)化的核酸提取方法適用于食品樣品中甲型肝炎病毒RNA的提取和檢測(cè)。

圖3 藍(lán)靛果樣品中檢出甲型肝炎病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 3 Real-time fl uorescence RT-PCR detection of HAV in blue honeysuckle sample

3 討 論

甲型肝炎病毒為引起食源性疾病的重要病原之一，但是該病毒在食品樣品中的檢測(cè)方法仍未成熟。在甲型肝炎病毒暴發(fā)的許多案例中，對(duì)可疑的食物確認(rèn)成為了最大的難點(diǎn)，原因?yàn)椋?）食品中甲型肝炎病毒含量較低；2）甲肝病毒培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)；3）從食品基質(zhì)中純化病毒遺傳物質(zhì)的方法效率較低；4）食品基質(zhì)中含有大量干擾物質(zhì)。因此，高特異性和靈敏度的PCR技術(shù)開(kāi)始廣泛應(yīng)用于漿果、蔬菜、水果、貝類等食品基質(zhì)中甲型肝炎病毒的檢測(cè)研究中[21-24]。現(xiàn)有的分子診斷方法中，病毒RNA提取是分子生物學(xué)檢測(cè)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，RNA的提取效率和質(zhì)量直接影響最終檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[23,25]。因此，選擇一種高效的RNA提取方法，對(duì)食品中甲型肝炎病毒的核酸進(jìn)行檢測(cè)至關(guān)重要。目前，市售的核酸提取試劑盒主要采用膜吸附、紙片法、磁珠吸附等技術(shù)進(jìn)行RNA提取，這些試劑盒在檢測(cè)時(shí)限、檢測(cè)準(zhǔn)確性、核酸提取效率等方面存在巨大差異[23,25]。對(duì)病毒核酸提取方法比較研究方面，呂艷等[25]對(duì)新城疫病毒的5種核酸提取方法的提取效率進(jìn)行了比較研究。王赤華等[26]僅對(duì)甲型H1N1流感病毒的3 種核酸提取方法進(jìn)行提取率的比較，而鮮有針對(duì)這些病毒核酸提取試劑盒進(jìn)行全面的分析比較研究的報(bào)道[22,27]。此外，對(duì)于食源性病毒檢測(cè)工作者來(lái)說(shuō)，花費(fèi)大量的時(shí)間和精力在眾多的商品化核酸提取試劑盒中選擇一種檢測(cè)效率高的試劑盒嚴(yán)重影響工作效率，也降低了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)準(zhǔn)確性，增加了檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)。本研究采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)甲型肝炎病毒的RNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增Ct值對(duì)3 種常用的商用病毒RNA提取試劑盒的提取效率、核酸抽提穩(wěn)定性、抑制劑去除效率、檢測(cè)靈敏度、綜合應(yīng)用等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，以找到食品中甲型肝炎病毒RNA的最佳提取方法。

本研究發(fā)現(xiàn)，在提取效率方面，ROCHE試劑盒要明顯優(yōu)于其他兩種試劑盒；在核酸抽提穩(wěn)定性方面，3 種核酸提取試劑盒均有良好的核酸抽提穩(wěn)定性；在抑制劑去除效率方面，3 種核酸提取試劑盒提取對(duì)于甲型肝炎病毒抑制劑的去除差異顯著，其中ROCHE 11858882001＞QIAGEN 74104＞ABI AM1836；在檢測(cè)靈敏度方面，饒紅等[28-29]對(duì)蔬菜、水果、貝類中甲型肝炎病毒進(jìn)行檢測(cè)研究，其中蔬菜中甲型肝炎的檢測(cè)靈敏度為30 TCID50/1.5 g，草莓中甲型肝炎的檢測(cè)靈敏度為48 TCID50/100 g，貝類中甲型肝炎的檢測(cè)靈敏度為10 TCID50/100 g。在本研究中，采用ROCHE 11858882001對(duì)貝類和樹(shù)莓樣品中的甲型肝炎病毒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏分別為6.32 CCID50/2 g和0.63 CCID50/20 g，檢測(cè)靈敏度均優(yōu)于報(bào)道方法。此外，在病毒RNA提取過(guò)程中，所取的病毒懸浮液量過(guò)大，會(huì)使提取液中殘留的抑制劑濃度過(guò)高，從而降低了病毒的檢測(cè)靈敏度，而取樣量過(guò)少，懸浮液中病毒含量過(guò)低也會(huì)降低病毒的檢測(cè)靈敏度[30]，本研究中，ABI AM1836提取所需病毒懸液僅為50 μL，這可能是ABI AM1836檢測(cè)效果較差的原因。在本研究中，ROCHE 11858882001具有較好的提取效果，表明在食源性甲型肝炎病毒檢測(cè)中，RNA提取的試樣量為200 μL就已經(jīng)足夠了。而綜合操作時(shí)間及成本等因素，ROCHE 11858882001具有良好的使用價(jià)值。

目前，從貝類樣品檢出甲型肝炎病毒的報(bào)道較多，而從草莓、樹(shù)莓、蘋果等水果蔬菜中檢出甲型肝炎病毒報(bào)道較少。莫雪梅等[31]從45 份草莓樣品檢出3 份甲型肝炎病毒陽(yáng)性樣品。房保海等[21]從216 個(gè)果蔬樣品種冷凍草莓、冷凍藍(lán)莓、冷凍土豆丁、冷凍蘋果丁和冷凍樹(shù)莓檢出了6 個(gè)甲型肝炎病毒陽(yáng)性樣品。Li Dan等[32]從2 015 個(gè)漿果樣品中檢出草莓和紅加侖2 個(gè)甲型肝炎病毒陽(yáng)性樣本。而本研究采用優(yōu)化好的RNA提取方法實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，于一份藍(lán)靛果樣品中檢出甲型肝炎病毒，對(duì)于研究小漿果中甲型肝炎病毒檢測(cè)方法具有重要意義。