轉錄組測序分析3 種不同鏈長脂肪酸對釀酒酵母基因轉錄水平的影響

韓 麗，李 磊，楊厚榮，何培新,2，黃 申,2,*

（1.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002；2.鄭州輕工業學院食品生產與安全河南省協同創新中心，河南 鄭州 450002）

釀酒酵母（Sacchromyces cerevisiae）是一種重要的食品安全級微生物[1-2]，目前通過釀酒酵母可以生物合成多種脂肪酸及脂肪酸類衍生物如脂肪酸乙酯[3-4]、脂肪醇[5-6]及油脂等[7-10]。脂肪酸乙酯及脂肪醇可以作為香料物質添加到食品當中[11]，如己酸乙酯是濃香型白酒香氣的重要成分之一，而己醇被研究證明是桑葚香氣成分的組成之一[12-14]。通過釀酒酵母合成脂肪酸類衍生物如己酸乙酯等首先需要釀酒酵母合成脂肪酸，再進一步通過不同的酶催化合成不同的化合物，而研究表明釀酒酵母體內游離的脂肪酸主要包括C18及C16的飽和及不飽和脂肪酸[15-16]，短鏈及中長鏈脂肪酸的含量相對較少[17-18]，因此限制其下游短鏈及中長鏈脂肪酸酯及脂肪醇的產量。如何控制釀酒酵母體內游離脂肪酸的鏈長，促進短鏈及中長鏈脂肪酸的合成，是提高釀酒酵母生物合成短鏈及中長鏈脂肪酸酯類及脂肪醇類等化合物首先需要解決的問題。

有研究提出在大腸桿菌中建立動態感應調控系統的概念[19-20]，其原理主要基于脂肪酸進入細胞內會轉化為脂酰基輔酶A，脂酰基輔酶A與轉錄因子FadR結合，從而開啟FadR抑制的啟動子啟動其下游基因的轉錄。通過將這種受調控的啟動子用于大腸桿菌脂肪酸合成及由脂肪酸起始的脂肪酸乙酯合成途徑中，胞內脂肪酸處于一種動態平衡態，細胞在感應脂肪酸的同時受其調控，其結果可增加產物脂肪酸乙酯的同時避免脂肪酸過度積累造成的一系列問題，同時減少副產物的積累。Dahl等[19]進一步通過轉錄組測序等在大腸桿菌中篩選到可響應法呢基焦磷酸脅迫的啟動子作為動態感應調控元件，提高了目標產物青蒿酸的積累并減少中間產物的量。Torella等[21]也在大腸桿菌中發現了通過類似的調控策略動態調控脂肪酸鏈長從而達到截短脂肪酸鏈長的目的。Xu Peng等[22]在大腸桿菌中設計并獲得響應丙二酰單酰基輔酶A調控元件，建立了在胞內響應丙二酰單酰基輔酶A的動態感應調控系統，脂肪酸的產量提高2.1 倍，達到3.8 g/L。

目前，釀酒酵母中源于脂肪酸的動態感應調控系統方面的報道較少[23]。這主要是因為釀酒酵母中脂肪酸的合成及鏈長延伸機制還未被明確闡述清楚[24-25]，釀酒酵母中響應脂肪酸的轉錄因子及轉運蛋白等還未被研究清楚[26]，因此，本實驗將代表3 種不同鏈長的脂肪酸己酸（C6）、十二烷酸（C12）及十六烷酸（C16）分別添加到對數期的釀酒酵母培養液中，通過轉錄組測序分析其對釀酒酵母基因轉錄水平的影響，對不同鏈長脂肪酸存在下釀酒酵母差異基因的表達進行分析，并對可能參與脂肪酸合成的轉錄因子及轉運蛋白進行預測，最后進一步分析3 種不同鏈長脂肪酸存在下，酵母脂肪酸合成途徑中關鍵酶基因的表達情況，為進一步闡明釀酒酵母響應不同鏈長脂肪酸的動態感應調控元件及其作用機制提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗中用到的釀酒酵母為BY4741（實驗室保存）。

Total RNA Extractor（Trizol） 生工生物工程（上海）股份有限公司；Qubit2.0 RNA檢測試劑盒、Qubit2.0 DNA檢測試劑盒 美國Thermo Fisher公司。

1.2 儀器與設備

搖床、超凈臺、臺式高速冷凍離心機、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度計、電泳儀北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 培養基配制

YPD培養基：葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，pH值自然。

發酵培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖5 g/L，氯化鈉10 g/L。

1.3.2 不同鏈長脂肪酸加入酵母細胞中的濃度及誘導時間確定

根據文獻報道并結合本實驗的要求[19,27-28]，將不同濃度的脂肪酸加入到酵母細胞中，通過OD600nm測定酵母細胞的生長情況，選取對酵母細胞生長影響較為一致的脂肪酸濃度作為最終的濃度加入酵母處于對數生長期的酵母培養基中，誘導培養6 h。其中C6終濃度為1 mmol/L，C12濃度為1 mmol/L，C16由于其存在一定溶解性的問題，最終確定濃度為1 mmol/L。在實驗過程選取30 mL培養基中加入600 μL混合的異丙醇-曲拉通X-100（3∶2）作為脂肪酸在酵母培養基中的助溶劑，其中對照組酵母中加入相同比例及體積的助溶劑以消除轉錄組測序過程中助溶劑產生的影響。

1.3.3 總RNA的提取

總RNA提取方法按照試劑盒說明書進行。通過Trizol提取試劑盒進行RNA提取，利用Nanodrop檢測RNA濃度及瓊脂糖凝膠檢測RNA完整性以及基因組污染情況。檢測合格的RNA用于后續測序。

1.3.4 轉錄組測序數據處理及分析

將提取后的RNA送入華大基因進行轉錄組測序分析，同時實驗設置2 個重復。使用R軟件里的cor函數進行相關性分析，使用R軟件里的hclust函數進行層次聚類分析，使用維恩圖展示樣品間基因表達分布。轉錄因子及轉運蛋白等的預測分析由R軟件中的phyper函數進行富集分析，此外，不同樣本間的基因表達差異均已RNA測序后的試劑讀數比值取log2的值來展示。

2 結果與分析

2.1 不同鏈長脂肪酸存在下的基因表達相關性分析

圖1 不同鏈長脂肪酸存在情況下及未加脂肪酸酵母菌株的基因轉錄情況分析Fig. 1 Transcriptional analysis of S. cerevisiae in the presence and absence of fatty acids with different chain lengths

在確保所提樣品RNA的質量及通過Nanodrop測定RNA的純度之后，對加入不同脂肪酸的酵母RNA樣本進行轉錄組測序，將所得數據結果對3 種不同鏈長脂肪酸存在時基因的轉錄情況進行歸類比較分析后發現，未加任何脂肪酸的酵母與C12脂肪酸存在時相關性最高，C16脂肪酸存在時次之，C6脂肪酸存在時其與對照菌株、C12及C16脂肪酸存在時相關性最低。進一步根據基因轉錄信息對各樣品進行聚類分析，發現這4 個樣品的聚類關系依次為C6、C16、C12及對照（圖1a、c）。進一步對C6、C12及C16存在時酵母的轉錄情況進行分析后發現，加入脂肪酸C6、C12及C16的酵母均有5 553 個轉錄本被檢測到（包括預測的新轉錄本），C6特異性的轉錄本包括132 個，C12特異性的轉錄本90 個，C16特異性轉錄本63 個，C12與C16共同轉錄本145 個，C6與C12共同轉錄本67 個，C6與C16共同轉錄本95 個（圖1b）。

2.2 不同鏈長脂肪酸存在下基因表達差異分析

在本實驗中，選取C6、C12以及C16脂肪酸分別代表不同鏈長的脂肪酸，通過轉錄組測序發現C6及C12相比差異最為不同，其中上調基因為466 個而下調基因為1 087 個，而與長鏈的脂肪酸如C16相比則上調307 個，下調733 個（圖2）。與對照未加脂肪酸菌株BY4741相比，加入脂肪酸之后，其中C6對釀酒酵母影響最大（上調基因591 個，下調基因317 個），此外，從數據分析來看，不同鏈長的脂肪酸加入酵母細胞之后，酵母胞內的基因表達差異更為明顯，這提示酵母細胞對不同鏈長的脂肪酸表現出不同的反應機制。

圖2 不同脂肪酸存在條件下的釀酒酵母基因表達差異情況分析Fig. 2 Differential expression of genes in S. cerevisiae in the presence and absence of fatty acids with different chain lengths

目前，已有報道包括釀酒酵母對多不飽和脂肪酸的響應[23]以及釀酒酵母對抗辛酸（C8）及癸酸（C10）的反應機制[24-25]等。本研究將結合已有的資料進一步分析其對不同鏈長脂肪酸的響應情況等。分別與對照未加入任何脂肪酸的菌株相比，3 種不同鏈長的脂肪酸共使得21 個基因上調及18 個基因下調（選取log2比值不小于1的進行統計）。C6、C12及C16脂肪酸均顯著促進UTP15、URA7、FDR4、PET117等基因的上調，在3 種不同鏈長的脂肪酸存在條件下，其與對照菌株相比，上調的倍數較為一致，這體現出3 種不同鏈長脂肪酸共同促進基因上調的趨勢較為一致。而對于3 種鏈長脂肪酸均使得轉錄水平下調的基因來說，C6、C12及C16均顯著抑制基因TOD6、TRM2、FEX1、STH1、RAD7、HEK2、POB3、NUP53、FMP49等的轉錄，而C6明顯抑制PHO5、LCP5及POL31基因的轉錄，C12則明顯抑制CRP1基因的轉錄（表1）。同時，實驗還對不同脂肪酸對釀酒酵母基因轉錄的影響進行了比較，C6與C12均會使得RCK2、YBR056W、YBR287W、PEX5、POX1、SAM50、PUS2、GPB2基因轉錄水平上調，SMM1、ETS1-1、ETS1-2、YLR256W-A、YIL156W-B、snR31、NME1、CEX1、MSG5、GFD1基因轉錄水平下調。C6與C16對釀酒酵母轉錄影響一致的基因包括37 個，其中RDH54、MRP10、ATG34、NST1、PHM8、MRPL32、SLU7、UBP10、SPC72、SNA2、RGD2基因上調，IMD4、ADR1、RPA190、CHS2、FAS1等26 個基因下調。C12與C16對釀酒酵母轉錄影響一致的基因包括50 個，其中16 個上調，34 個下調。在此基礎上，剔除掉上述各個脂肪酸影響一致的基因之后，分別對C6、C12及C16脂肪酸分別對酵母基因轉錄水平的影響進行分析（除去轉錄組測序時轉錄條數小于10，Read counts小于10的基因），發現C6特異性影響釀酒酵母的基因數為165 個，C12為40 個，C16為5 個。

表1 C6、C12及C16對釀酒酵母轉錄水平影響一致的基因Table 1 Transcription levels of genes in S. cerevisiae consistently affected by C6, C12 and C16

續表1

2.3 不同鏈長脂肪酸存在下可能參與的轉錄因子及轉運蛋白

在生物體內，轉錄因子的表達量相對較少，通過轉錄組測序并進一步分析轉錄數據，發現3 種不同鏈長的脂肪酸存在條件下對于釀酒酵母體內的轉錄因子的轉錄水平是有影響的，共有17 條轉錄因子的轉錄受到了影響（表2），其中HMRA1受到3 種鏈長脂肪酸的影響后轉錄明顯上調。脂肪酸C6及C16促進GSM1、SWI4、TEC1、RSC3轉錄因子的轉錄，短鏈脂肪酸C6與長鏈脂肪酸C16相比明顯促進上述基因的轉錄，中長鏈脂肪酸C12則抑制以上轉錄因子的轉錄；而同樣C6及C16抑制CUP2、DUR1,2的轉錄，C12則相反使得其上調。此外，C6特異性促進CIN5、YAP7、VPS72、HMLALPHA2、MATALPHA2、CAD1轉錄因子的轉錄（C12及C16抑制）而抑制ARG80的轉錄。3 種脂肪酸共同使得MCM1轉錄水平下調。

表2 3 種不同鏈長脂肪酸對釀酒酵母轉錄因子轉錄水平的影響Table 2 Inf l uence of fatty acids with different lengths on transcript factors in S. cerevisiae

進一步對3 種鏈長脂肪酸存在條件下，對轉運蛋白的基因轉錄情況進行分析后發現，共得到受3 種脂肪酸影響的轉運蛋白有61 個，進一步對其中40 個轉運蛋白進行分析（表3），其中11 個基因均受C6、C12及C16的影響，ALR1、RIP1、MRH1、QCR9、ATR7及QCR7分別被上調而KAP120、DNF2、THI7、FMP49及MMP1被下調；C6及C12均會導致APL1、TRK1、QCR8及QCR6基因轉錄水平的上調而C12及C16對轉運蛋白影響相一致的基因包括12 個，其中3 個上調，9 個下調；此外，C6特異性影響8 個轉運蛋白的轉錄，C12特異性影響3 個而C16則特異性影響2 個。

表3 3 種不同鏈長脂肪酸對釀酒酵母中轉運蛋白轉錄水平的影響Table 3 Inf l uence of fatty acids with different chain lengths on transporter proteins in S. cerevisiae

2.4 不同鏈長脂肪酸對脂肪酸合成途徑的影響

釀酒酵母脂肪酸合成途徑包括前期脂肪酸合成到16 個碳脂肪酸之后進入長鏈脂肪酸的合成，而脂肪酸機體需要時可以通過β氧化途徑進一步降解為乙酰輔酶A（圖3），通過轉錄組測序，進一步比較分析不同鏈長脂肪酸存在條件下，釀酒酵母脂肪酸的合成及降解途徑受到的影響，發現與對照未加任何脂肪酸酵母菌株相比，3 種不同鏈長的脂肪酸存在條件下，8 個基因的轉錄水平受到了影響，其中除2 個不飽和脂肪酸降解所需的異構酶ECI1及ECI2外，其他6 個基因在圖3中標注了其作用位點。從圖3可發現，以C12為代表的中長鏈脂肪酸在整個釀酒酵母的脂肪酸合成及降解過程中均起到促進基因轉錄的作用，如ACC1、FAS1、FAS2、ELO1、FAA3及POX1；而短鏈脂肪酸C6則抑制脂肪酸的合成過程中ACC1、FAS1及FAS2的轉錄及長鏈脂肪酸的合成相關基因Elo1，C6卻促進脂肪酸降解途徑β氧化途徑關鍵酶基因POX1的轉錄水平上調；C16與C6作用相似，但是其與C6脂肪酸不同的是，C16促進長鏈脂肪酸的合成，抑制了脂肪酸到乙酰輔酶A的降解過程。

圖3 3 種不同鏈長脂肪酸對釀酒酵母脂肪酸合成及降解途徑的影響Fig. 3 Effects of fatty acids with different chain lengths on fatty acid biosynthesis and degradation pathways in S. cerevisiae

3 討論與結論

本研究通過轉錄組測序分析了不同鏈長脂肪酸對于釀酒酵母基因轉錄水平的影響，結果發現3 種脂肪酸中短鏈脂肪酸如C6對酵母基因的轉錄水平影響最大，相比于C12及C16脂肪酸，C6對酵母細胞的形成過程、細胞膜的組成以及細胞的生長及凋亡等影響最為明顯，如MIC27、RGI1、PIC2、INH1、ATP1、YPR010C-A、ATP3、EXO70、MGM1、IRR1、YKR078W、MCR1、SST2、CLB4、GRX1、STE2、PEP12、GIN4、COX12、TOM70、ATP25、RNY1、CMK2、AIM24、GDI1、ISM1、COA6基因轉錄水平明顯上調，而ALG3、TMA19、EMC3、SUR7、MCH5、RPS27B、HUT1、ERC1、ARG80、HEM1、PPX1、MDE1、NAP1、ARN2、RCL1、RPS21A、SMX3、EFM4、DUT1、PDR10、AIM46等基因則下調，C6脂肪酸存在條件下，細胞受到脅迫后的應激基因如FUS2、HSP82、HSP78、HSP104均明顯上調；此外，C6脂肪酸存在時一些基因在基因信息的傳遞過程如結合、折疊、分選及降解過程、轉錄過程及翻譯調控過程等受到影響，這些基因包括RIE1、TPH3、TFA1、MSC1、HRR25、NMD2、ZTA1、COX6、DOG2、BAR1、DOA4、SKO1、MSH5、APL2、TMC1、MSS1、HFD1、RPL36B、YER152C、RPL23B、ADO1、RPA12、ITR1、OPI3等，此類基因中明顯受C12影響的基因則包括RPN8、HDA2、MKT1、YKR070W等，相比之下，這類基因中受C16脂肪酸影響的較少；3 種脂肪酸存在條件下除脂肪酸代謝途徑受到影響，糖的代謝途徑會受到一定影響，如C6導致SOL4、MDH1基因明顯上調，而C12導致GSC2、INO1、PRM7基因明顯下調；同時，C6影響氨基酸代謝途徑中TDA10、MDE1基因上調，而C12明顯使得TYR1基因上調；值得關注的是，C16特異性影響基因HAM1明顯上調，HAM1為三磷酸肌苷焦磷酸酶，為細胞中能量儲存過程中的酶[27-30]。

通過轉錄組測序，對一些可能的轉錄因子及轉運蛋白進行分析及預測，在生物體內，轉錄因子的表達量并不多，在后續的實驗中，將進一步研究不同脂肪酸存在下，分析差異表達轉錄因子的功能，同時將結合不同脂肪酸的表達差異基因進一步尋找不同的轉錄因子[27,30]。而對于轉運蛋白的差異，后續的實驗需要進一步對其驗證，轉運蛋白對于釀酒酵母生物合成脂肪酸途徑具有重要意義。

最后本研究分析不同脂肪酸存在下，釀酒酵母脂肪酸合成途徑受到的影響，研究發現短鏈及中長鏈脂肪酸可一定程度上促進β氧化途徑的進行，中長鏈脂肪酸促進整個脂肪酸合成及延伸途徑的進行，而長鏈脂肪酸促進長鏈脂肪酸的延伸過程，對于此現象的機理還需要進一步研究。

本研究通過高通量測序分析不同鏈長脂肪酸存在條件下，釀酒酵母體內基因轉錄的差異，為后續研究釀酒酵母脂肪酸合成途徑的動態感應調控元件提供了豐富的數據資源。