轉谷氨酰胺酶對大豆分離蛋白乳狀液凍融穩定性的影響

于國萍，岳崇慧，陳 媛，劉 鵬，劉艷秋，董良偉

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

乳狀液是一種非均多相分散體系，常見的乳狀液由油水兩相組成。乳狀液通常有2 種類型，即水包油型乳狀液和油包水型乳狀液，其中水包油型乳狀液在食品工業中應用廣泛，如加工蛋黃醬、調味料、飲料、冰激凌等[1]。這些產品的加工可能會需要混合、剪切、加熱、冷藏、冷凍、脫水處理。其中冷凍處理是食品抑制微生物、維持化學穩定性和延長貨架期的重要手段之一[2]。水包油乳狀液在冷藏、冷凍食品和藥品中有許多應用，而在其使用前往往需要經歷冷卻和融化的過程[3-4]。因此，如何增強乳狀液的凍融穩定性成為近年來的研究熱點。

在植物源蛋白質中，大豆蛋白由于其廣泛的功能特性和較高的營養價值在食品體系中得到廣泛的應用[5-7]。然而大多數大豆蛋白乳狀液在冷凍-解凍的過程中會形成冰晶，尖銳的冰晶對乳狀液界面膜形成機械破壞，改變原有穩定體系的蛋白-蛋白交互作用，解凍后乳狀液將發生聚結、出油和分層等失穩現象[8-9]。大豆分離蛋白（soybean protein isolated，SPI）的功能性質可以通過物理、化學、酶法進行修飾。酶法改性是在溫和條件下利用酶制劑催化蛋白水解或聚合，改變SPI的氨基酸殘基和多肽鏈、破壞蛋白質分子的空間結構、改變蛋白質分子的理化性質，從而獲得具有較好功能特性和營養性的SPI[10]。目前國內外學者的研究主要集中在利用轉谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）提高蛋白質乳化性[11-13]，對于利用TGase提高SPI凍融穩定性且在TGase改性SPI形成的乳化體系中對于乳狀液凍融過程中結晶晶體形成及融化的熱特性與凍融穩定性的關系研究報道較少。且已有研究表明添加乳化劑可有效改善冰激凌基料在貯運過程中的穩定性，而冰激凌在日常銷售及家庭貯藏期間溫度多為-18 ℃，研究利用優質蛋白資源SPI制備乳狀液在該溫度條件下進行凍融循環，以期具有實際意義。

本實驗通過研究凍融循環次數、TGase交聯時間、添加量對乳化體系的分層系數、出油率的影響，確定TGase交聯時間及添加量，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳確定酶促反應對于蛋白組成的影響，比較分析2 種乳狀液體系顯微結構、熱特性，探究改性蛋白組成及熱力學行為對體系凍融穩定的影響，從而為大豆蛋白在冷凍食品的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆油 黑龍江省哈爾濱市九三集團；SPI 北京索萊寶科技有限公司；TGase 泰興市東圣食品科技有限公司；十二烷基硫酸鈉、蘇丹III試劑 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

722-2000型分光光度計 山東高密彩虹分析儀器有限公司；Pyris6型差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC） 美國PE公司；T18 Basic高速分散機/勻漿機 德國IKA公司；ChampGel 6000全自動凝膠成像分析儀 北京賽智創業科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 TGase交聯樣品的制備

將SPI用去離子水配制成質量分數為1.0%溶液，調整溫度為50 ℃，調整pH值至7.0，分別加入一定量的TGase，梯度為0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%（酶/底物）開始交聯，反應1～5 h后80 ℃加熱5 min使酶失活，冷卻至室溫后調整pH值至7.0，離心，凍干。同時以未加TGase的SPI作為零交聯時間、零添加量的對照。

1.3.2 乳狀液的制備

參考Kimura等[14]方法進行制備。取15 mL的1% SPI或交聯樣品加入5 mL大豆油利用高速勻漿機于12 000 r/min均質2 min，制得水包油型乳狀液。

1.3.3 凍融循環

將制備好的乳狀液置于-18 ℃的冰箱中冷凍22 h后，取出置于40 ℃水浴鍋中解凍2 h，此過程稱為1個凍融周期。乳狀液分別進行1、2、3 個凍融周期處理，并在每次循環后進行穩定性分析。

1.3.4 分層系數測定

取10 mL新鮮乳狀液至離心管中，凍融循環后，乳狀液開始分層，上層為不透明的乳化層，下層為透明的乳清層。分層系數按公式（1）計算：

式中：Hs為乳清層高度/cm；Ht為乳狀液總高度/cm。

1.3.5 出油率測定

參考Palanuwech等[15]的 測定方法并 略加改動。蘇丹III油 溶液的制備：精確稱取 蘇丹III色素0.015 g，加入1 000 g大豆油中在室溫（25 ℃）條件下慢速 攪拌12 h左右，使蘇丹III完全溶解，于波長508 nm處測定蘇丹III油溶液的吸光度（A1）。準確稱取 待測樣品 乳狀液16 g，制備好的蘇丹III油溶液4 g，混合 均勻，1 000×g離心20 min，用移液槍吸取 乳狀液上層，于15 000×g離心20 min，取上層清液 于波長508 nm處測定吸光度（A2）。原油為空白調零。出油率按公式（2）計算：

式中：φd為乳狀液中脂肪質量分數/%；M0為加入的蘇丹III油液的質量/g；Me為乳狀液的質量/g；a=A1/A2。

1.3.6 乳狀液的光學顯微結構觀察

吸取20 μL乳狀液滴于帶有凹槽的載玻片中心，蓋上蓋玻片，注意不要產生氣泡，將載玻片置于載物臺上觀察，先在4 倍物鏡下找到清晰的視野，然后再10 倍物鏡下放大倍率（10×10）進行乳狀液液滴顯微結構觀察。

1.3.7 DSC法測定

參考Noshad等[16]的 測定方法并略加改動。乳狀液的熱行為利用DSC進行表征。吸取10 μL依照1.3.2節方法制備的SPI新鮮乳狀液、TGase改性SPI新鮮乳狀液置于鋁制坩堝中，然后密封，移至DSC樣品池中，以1 個空鋁制坩堝作為參比。樣品在DSC中以5 ℃/min從20 ℃到-20 ℃進行降溫，然后以相同的速率從-20 ℃到20 ℃進行升溫。此溫度循環重復3 次。

大豆油的熱行為測定參考Magnusson等[17]的測定方法并略加改動。大豆油（10 μL）置于鋁制坩堝中，然后密封，移至DSC樣品池中，以1 個空鋁制坩堝作為參比。樣品在DSC中以5 ℃/min從30 ℃至-30 ℃進行降溫。

1.3.8 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯亮藍蛋白質染色[18]測定蛋白質的亞基組成及變化。用去離子水將SPI及TGase改性SPI配制成3 mg/mL的樣品溶液，取蛋白樣品溶液與上樣緩沖液1∶1混合，電泳前沸水浴中煮沸5 min。進樣量為標準蛋白每孔5 μL，樣品每孔10 μL。實驗中分離膠和濃縮膠分別為12%和5%。樣品在濃縮膠時電壓為60 V，分離膠電壓為90 V。之后用考馬斯亮藍染色，最后脫色至條帶清晰，于凝膠成像系統進行成像。

1.4 數據處理

每個實驗重復3 次。實驗數據采用IBM SPSS 19.0軟件進行統計分析。采用Origin 9軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 TGase對SPI乳狀液凍融穩定性的影響

2.1.1 TGase交聯時間對分層系數和出油率的影響

如圖1所示，在固定TGase添加量（2.5%）時，隨著交聯時間的延長，乳狀液的出油率及分層系數均呈下降趨勢，均低于SPI（交聯時間0 h）。當交聯時間達到3 h時，乳狀液的出油率及分層系數最低，乳狀液呈現出較好的抗凍融穩定性，而當交聯時間超過3 h時，乳狀液的分層系數及出油率有所增加，這可能是由于延長時間會導致大豆蛋白的大量聚集，乳狀液體系發生絮凝，從而加劇乳狀液分層、油滴的析出[19]。本實驗選取交聯時間為3 h。

圖1 TGase交聯時間對乳狀液體系分層系數（A）和出油率（B）的影響Fig. 1 Effect of TGase crosslinking time on creaming index (A) and oiling off (B)

2.1.2 TGase添加量對分層系數和出油率的影響

圖2 TGase添加量對乳狀液體系分層系數（A）和出油率（B）的影響Fig. 2 Effect of TGase dosage on creaming index (A) and oiling off (B)

由圖2可知，當交聯時間為3 h時，隨著TGase添加量的增加，乳狀液的出油率及分層系數呈下降趨勢，均低于SPI。當添加量為1.5%時，乳狀液的出油率及分層系數最低，乳狀液呈現出較好的抗凍融穩定性，而當添加量超過1.5%時，乳狀液的分層系數及出油率有所增加，表明大豆蛋白的過度交聯會使其乳化能力下降，油滴聚集。本實驗選取TGase添加量為1.5%。即改性蛋白在制備條件為TGase交聯時間3 h、添加量1.5%時穩定性較好，在3 次凍融循環后，該改性蛋白制備的乳化劑其分層系數、出油率分別為16.11%、15.59%，而SPI分層系數及出油率分別為52.15%、48.74%。

隨著凍融循環次數的增加，乳狀液出油率及分層系數增大，乳狀液的穩定性逐漸下降。其原因主要是，在乳狀液冷凍過程中，當冰晶開始形成時，在未冷凍的液相中分散的乳狀液液滴會彼此靠近進而發生聚集，此現象的發生可能是由于界面膜被破壞進而促進了乳狀液聚集。而在乳狀液融化過程中，尖銳的冰晶可能會物理性的滲透破壞油滴并且打破乳狀液油與水的界面膜，使油滴更加傾向于聚集[9]。另外，當乳狀液冷凍時，SPI可能會變性進而降低其乳化性、保水性、保油性等功能特性[19]。因此，冷凍處理使蛋白的乳化性降低、油-水混合體系中界面膜變得不穩定，會加劇油滴之間的聚集和絮凝，是凍融循環使乳狀液失穩的主要原因。

TGase的交聯作用一定程度地提高了SPI乳狀液的凍融穩定性，一些物理化學機制可以用于解釋TGase提高了蛋白在凍融條件下的穩定性。TGase的適度添加提高了蛋白乳化性能，形成更加致密穩定的界面膜，從而提高蛋白乳狀液的凍融穩定性[20]。SPI交聯后蛋白-蛋白作用的提高、蛋白在界面吸附能力的改善都增強界面蛋白的強度，從而改善SPI的乳化能力[21]。已有研究表明TGase的適量添加可提高蛋白質的乳化性。Hu Xiao等[11]利用TGase提高了花生分離蛋白的乳化性能。徐瑩[12]通過研究發現TGase對SPI乳化活性、乳化穩定性具有改善作用。黃志良等[13]研究β-酪蛋白經TGase不同程度的作用后乳化性質的變化。經TGase作用，β-酪蛋白所形成的乳化體系的穩定性明顯提高。經處理，β-酪蛋白形成的乳化體系在30 h內未見油水分離，但當TGase處理時間過長，交聯程度過高的情況下，乳蛋白質乳化能力會下降，乳化體系中油滴體積增大。這與本研究中當交聯時間及酶量添加到一定程度時，其乳狀液凍融穩定性會下降的結果相符。其原因可能為蛋白過度交聯導致其在乳狀液的均質過程中無法迅速遷移到油水界面[22]，從而導致乳化能力的下降。另外蛋白的過度交聯，會使蛋白大量聚結，聚合的蛋白質會吸附在液滴水膜的兩側，形成“橋連效應”，使乳狀液體系發生絮凝，從而加劇乳狀液分層[19]。其次是黏度的影響，TGase的交聯增加乳狀液中未冷凍水的量和水相的黏度，使油滴運動變得困難，降低油滴聚結現象的發生[23]。由于TGase部分脫酰胺基作用，其處理會降低蛋白分子表面疏水性、增加靜電排斥[24]。

2.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定結果

大豆蛋白的主要組分為7S球蛋白和11S球蛋白。7S球蛋白是由α、α′和β亞基構成；11S球蛋白是由酸性亞基和堿性亞基通過二硫鍵組成的六聚體[25-26]。電泳圖譜是分析蛋白質亞基組分的重要手段。由圖3可以看出，隨著TGase添加量的提高，TGase改性SPI在116.0 kDa以上出現的新的蛋白條帶顏色逐漸加深，而在45.0～66.2 kDa之間的條帶逐漸消失，部分β-伴球蛋白通過TGase交聯或聚合形成了較高分子質量的聚合物。這與Tang Chuanhe等[27]研究一致。結合圖1、2可知，當TGase交聯時間3 h、TGase添加量1.5%時制備的TGase改性SPI凍融穩定性最佳。條帶3為該條件制備的改性SPI，此時交聯程度居中，這也證明交聯程度過高，反而使乳狀液凍融穩定性下降。可以預料，TGase改性SPI改變其蛋白質組成，使其功能性質發生改變。

圖3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig. 3 SDS-PAGE analysis

2.3 TGase改性對乳狀液微觀結構的影響

圖4 TGase改性對乳狀液微觀結構的影響Fig. 4 Effect of TGase modification on the microstructure of the emulsion

如圖4所示，新鮮SPI、TGase改性SPI乳狀液油滴粒徑較均一、穩定。當乳狀液經凍融處理后，觀察區域中出現了較大的球狀顆粒，且有明顯的聚結現象，這說明乳狀液的穩定性遭到破壞，發生絮凝、聚結、油滴上浮。相對而言，TGase改性SPI與同次循環的SPI相比聚結程度相對較低，上述變化相對較小。這進一步印證了TGase改性大豆蛋白可有效抑制凍融過程中微觀液滴的聚集現象，從而得到穩定性較好的乳狀液。

2.4 凍融過程中熱特性分析

圖5 大豆油（A）和SPI乳狀液及TGase改性SPI乳狀液（B）DSC曲線Fig. 5 DSC curves of soybean oil (A), SPI emulsion and TGasemodified SPI emulsion (B)

利用DSC可以研究乳狀液體系中油、水結晶對于其穩定性的影響，結晶、熔融曲線可用來區別被乳化的油和未被乳化的油[15]。利用DSC分析乳狀液樣品之前，本研究使用DSC測定大豆油在冷凍過程中的熱行為，如圖5A所示，大豆油開始結晶溫度在-17 ℃左右。說明乳狀液在-18 ℃進行冷凍時（僅比大豆油結晶溫度低1 ℃），油相幾乎保持為液體狀態。

如圖5B所示，在冷凍過程中，SPI及其改性產物乳狀液只出現一個結晶峰。這是由于連續相（水相）造成的。基于以上的觀察，可以確定乳狀液微滴在-18 ℃冷凍22 h期間油在其中并沒有結晶。所以水包油乳狀液凍融條件下失穩主要是由于在冷凍階段冰晶形成失穩造成的。

在SPI乳狀液3 次凍融循環的過程中，其在20 ℃左右會觀察到一個比較明顯的放熱峰，這表明游離脂肪的存在，出現該現象的原因是由于油滴的部分聚集[28]，而在TGase改性產物乳狀液3 次循環中，其在20 ℃左右出現的放熱峰較緩。這也說明TGase改性產物在凍融循環中表現得更加穩定。

3 結 論

TGase對SPI的改性可以提高其乳狀液體系的凍融穩定性。不同TGase交聯時間、添加量改性的SPI乳狀液具有不同的凍融穩定性。改性蛋白在制備條件為TGase交聯時間3 h、添加量1.5%時穩定性較好，在3 次凍融循環后，該改性蛋白制備的乳化劑其分層系數、出油率分別為16.11%、15.59%，而SPI分層系數及出油率分別為52.15%、48.74%，所以相較于SPI作為乳化劑的乳化體系其凍融穩定性得到很大提高。TGase的改性會對SPI乳狀液體系凍融過程中熱特性產生影響，使SPI形成較大分子質量的蛋白質聚集體，蛋白組成的改變影響乳狀液凍融穩定性。本研究拓寬了豆基食品在食品工業的應用范圍。