高產纖維素酶突變株的篩選及其產酶條件優化

鄒宗勝，王婧雅，趙運英，毛 銀，鄧 禹*

（江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

纖維素酶是能夠分解纖維素生成葡萄糖的復合酶的總稱，可以用于動物飼料、食品、紡織品、洗滌劑和紙張的制造中[1-2]。在食品工業中，纖維素酶可廣泛用于果汁和蔬菜汁的澄清、果汁和果泥的生產以及橄欖油的提取等[3]。而在飼料加工過程中，纖維素酶則可降低粗纖維的含量從而提高牧草的品質[4]。

目前，研究較多的產纖維素酶菌種主要為曲霉（Aspergillus sp.）、青霉（Penicillium sp.）、木霉（Trichoderma sp.）和腐質霉（Humicola sp.）等真菌[5]。由于真菌酶系發達，產酶效率高，且所產的纖維素酶組成豐富、結構合理，最終使得纖維素酶活力較高；同時由于真菌產纖維素酶易于分離提取[6]，因此也易于生產放大。在這其中，里氏木霉研究最多，應用最廣，里氏木霉是獲得美國食品藥品監督管理局認證的安全無害菌株，它分泌的纖維素酶穩定性好、結構合理、且易于分離純化[7]。陸晨等[8]用里氏木霉RUT-C30進行上罐發酵，96 h時纖維素酶活最高，達到3.46 IU/mL。

常壓室溫等離子體誘變（atmospheric room temperature plasma mutation system，ARTP）是一種新型的誘變技術。等離子體可較易產生，并在室溫和大氣壓下破壞DNA鏈，導致染色體斷裂、重排、缺失并具有DNA損傷修復抑制。因其具有安全、成本低、操作靈活、突變譜高和突變率高等優異特性而在微生物誘變育種領域得到廣泛應用[9-10]。

本實驗以里氏木霉RUT-C30為出發菌株，利用ARTP篩選高產纖維素酶突變菌株，并通過全基因測序分析其突變類型。最后，通過優化發酵條件來提高纖維素酶產量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

里氏木霉RUT-C30購自廣東微生物菌種保藏中心，菌種保藏編號：GIM 3.536。

剛果紅染料 生工生物工程（上海）股份有限公司；玉米漿 上海源葉生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 培養基

PDA培養基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。

初篩培養基：CMC-Na 10 g/L，乳糖3 g/L，(NH4)2SO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO41.0 g/L，剛果紅0.2 g/L，瓊脂粉20 g/L。

種子培養基：葡萄糖15 g/L，酵母浸膏20 g/L，(NH4)2SO42.5 g/L，KH2PO46 g/L，MgSO40.8 g/L，CaCl21.0 g/L，Mandels微量元素營養鹽1 mL/L[10]，吐溫80 2 mL/L，pH 4.8。

發酵培養基：乳糖18 g/L，微晶纖維素10 g/L，玉米槳粉12 g/L，(NH4)2SO40.5 g/L，MgSO41 g/L，CaCl20.5 g/L，Mandels微量元素營養鹽1 mL/L[11]，吐溫80 2 mL/L，pH 4.8。

1.2 儀器與設備

Artp-iis ARTP誘變系統 無錫源清天木生物科技有限公司；SW-CJ-1D無菌操作臺 蘇州凈化設備有限公司；MJX-100B-Z霉菌培養箱 上海博訊實業有限公司；BIOTECH-5BG-7000A 5 L發酵罐 上海保興生物設備工程有限公司；EPOCH2T酶標儀 美國BioTek公司；LEGEND MICRO 17離心機 賽默飛世爾科技公司；Chromaster高效液相色譜儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養

將PDA斜面保存的里氏木霉RUT-C30孢子用無菌水洗下，無菌條件下接種于種子培養基，200 r/min、30 ℃培養3 d。

5 L發酵罐放大培養：裝液量3 L，接種量10%，通氣量1 L/（L·min），攪拌轉速200 r/min，pH 5.0，發酵周期為6 d，自接種起每12 h取一次樣測定干質量、濾紙酶活以及發酵液中的乳糖含量。

1.3.2 誘變致死率曲線及正突變率曲線

將斜面上洗下的新鮮孢子用無菌水稀釋至107～108個/mL，取0.01 mL菌液均勻地涂在金屬載片上。把裝有樣品的金屬載片平板放到ARTP誘變系統操作室里，照射距離2 mm，逐漸延長誘變時間（0、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260 s）進行實驗[12]。誘變結束后，用無菌鑷子把金屬載片移至裝有1 mL無菌水的EP管里，迅速振蕩均勻制成新的孢子懸液。將誘變后的孢子懸液適當稀釋后均勻涂布于營養豐富的種子培養基中，30 ℃恒溫恒濕培養4 d后記錄下各平板的菌落數，并根據稀釋倍數計算誘變致死率，如式（1）所示：

正突變率：相同的稀釋梯度下，將適當稀釋的里氏木霉RUT-C30孢子和經不同誘變劑量處理后的孢子均勻涂布于初篩平板中。30 ℃培養4 d后計數并分別測量每個菌落的水解圈與菌落直徑。以對照組菌落（未經誘變）的水解圈與菌落直徑的比值（H/C）為標準，當突變株H/C大于對照組H/C的最大值時記為正突變，小于對照組H/C的最小值時記為負突變。正突變率計算如式（2）所示：

1.3.3 里氏木霉RUT-C30的ARTP誘變及高產菌株的篩選

在一定的誘變處理時間條件下對里氏木霉RUT-C30進行誘變操作。將誘變得到的孢子適當稀釋涂布于CMC-Na剛果紅平板上，30 ℃培養4 d后根據水解圈（H/C值）的大小，選擇合適的單菌落，挑取孢子接種于發酵培養基搖瓶培養5 d，并以總酶活作為高產菌株的選擇依據。

1.3.4 菌體干質量的測定

取潔凈的定量濾紙置于烘箱中45 ℃烘干至質量恒定后于分析天平內記為M1。每次取10 mL發酵樣品用布氏漏斗抽濾，菌絲用去離子水沖洗兩遍，將該濾紙置于45 ℃烘箱中烘干48 h后于分析天平內稱質量記為M2[13]。另取10 mL的發酵液，6 000 r/min離心5 min去上清液，加入3 mL硝酸和醋酸的混合溶液重懸（15 mL純硝酸與150 mL 80%的醋酸的混合溶液）。沸水浴30 min后4 000 r/min離心2 min去上清液，沉淀用去離子水清洗3 遍后45 ℃烘干至質量恒定并稱質量記為M3[14]。根據式（3）計算10 mL發酵液中的菌絲干質量M：

1.3.5 高產纖維素酶突變株的全基因組測序

高產纖維素酶突變株JNDY-13的測序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，采用Illumina Genome Analyzer（HiSeq 2500）系統，測序步驟如Ivanova等[15]所述。研究分析了兩個獨立樣本，基因組序列已上傳至SRA，編號為：SRP124905。

1.3.6 纖維素酶活力活測定

以濾紙（Whatman Filter Paper No. 1）作為底物測定纖維素酶總活力：將1 cm×6 cm（50 mg）大小的濾紙條置于裝有1 mL檸檬酸緩沖液（50 mmol/L，pH 4.8）的試管中作為反應底物，然后加入500 μL經過適當稀釋的發酵上清液，空白對照對應加入500 μL檸檬酸緩沖液（50 mmol/L，pH 4.8）。將試管置于恒溫振蕩水浴鍋中，50 ℃反應1 h，立即加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫，加入20 mL去離子水，混合均勻后測定540 nm波長處的吸光度[16]。發酵培養基中的殘留乳糖通過高效液相色譜測定：Bio-Rad HPX-87P 色譜柱，柱溫30 ℃，流動相為5 mmol/L的稀硫酸，檢測器為視差檢測器[17]。纖維素酶活力單位（IU）定義：1 個酶活力單位是指在50 ℃與pH 4.8 的條件下，每分鐘分解產生1 μmol葡萄糖所對應的酶量。

1.3.7 正交試驗設計

根據已有的報道[18]，設計6因素5水平的正交試驗對培養基的組分含量進行優化[19]。按照試驗設計分別配制發酵培養基，以10%的接種量轉接種子液，30 ℃、200 r/min 搖床培養6 d，每12 h取樣測濾紙酶活。采用統計學方法分析實驗結果，并以濾紙酶活為標準確定最優培養基配方。

發酵過程，主要對發酵溫度、轉速以及通氣量3 個重要的發酵條件進行優化。首先進行單因素試驗，然后設計3因素2水平正交試驗，按照試驗設計的條件分別進行發酵實驗。實驗結果采用統計學方法進行分析，并以濾紙酶活為標準確定最優發酵條件。

1.3.8 流加發酵

根據正交試驗優化的最佳發酵條件和最優培養基配方進行流加發酵，發酵過程中補加乳糖和(NH4)2SO4的混合溶液（乳糖125 g/L，(NH4)2SO427.5 g/L），補加乳糖的總量不超過50 g/L。

2 結果與分析

2.1 里氏木霉RUT-C30的ARTP誘變

2.1.1 最佳照射時間的確定

將里氏木霉RUT-C30的新鮮孢子經ARTP 誘變照射不同時間后涂布于營養豐富的培養基進行再生培養，根據再生單菌落數計算致死率，結果如圖1所示。菌體致死率隨照射時間的延長迅速增加，當照射時間為200 s時，菌體致死率達到98%以上，當達到280 s時，無菌體生長。由正突變率曲線可知，當照射時間為240 s時正突變率最高為20.1%，故選擇240 s的照射時間進行實驗。

圖1 ARTP誘變致死率曲線及正突變率曲線Fig. 1 Lethality curve and positive mutation rate curve of ARTP mutagenesis system

2.1.2 高產菌株的初篩及復篩

剛果紅是一種染料，它可以與培養基中的纖維素多糖物質結合形成紅色復合物，但并不會與纖維二糖、葡萄糖、纖維素酶和纖維素分解菌發生反應[20-21]。根據水解圈的大小從87 株突變株中獲得20 株產纖維素酶活力較高的菌株進行搖瓶復篩，由圖2可知，菌株JNDY-13的總酶活力（濾紙酶活）可達2.21 IU/mL，為出發菌株里氏木霉RUT-C30的2.21 倍，且該菌產酶經10 次傳代仍保持穩定，因此選擇JNDY-13進行后續實驗。

圖2 搖瓶復篩結果Fig. 2 Screening results through shake-f l ask fermentation

2.2 高產纖維素酶突變株JNDY-13的突變分析

為研究高產突變株JNDY-13的遺傳變化，利用Illumina Genome Analyzer（HiSeq 2500）對其進行高通量基因組測序，并借助MOM算法[22]將Illumina系統產生的序列讀數與里氏木霉RUT-C30的參考基因組進行比對。對于JNDY-13，27 934 787 個（占總數的94.69%）單端讀數被繪制，且Illumina測序的平均深度為123.747。點突變和其他突變事件結果分析如圖3、4所示，在JNDY-13基因序列中鑒定出752 個突變，其中18 個為水解酶類，34 個為合成酶類，20 個為激酶，52 個與能量代謝相關，73 個與物質運輸相關，38 個與轉錄和翻譯相關，8 個與生長相關，399 個為假定蛋白，其中110 個與其他功能相關。其中，752 個單核苷酸多態性中的105 個被確認為點突變，336個突變為堿基缺失，165 個為堿基插入，99 個為混合突變。

圖3 JNDY-13高產菌株中的突變組成Fig. 3 Mutation composition of JNDY-13

圖4 JNDY-13高產突變株中突變的類型Fig. 4 Mutation types of JNDY-13

經比對發現，已知相關的纖維素酶類基因（cel2A、cel3A、cel2B、cel3C、cel5A、cel6A、cel7A、cel7B、cel61A）未發生突變，關鍵的調控因子相關基因（ace1、ace2、cre1、xyr1）亦未發生突變。與跨膜轉運和細胞滲透性相關的基因突變可能對纖維素酶的分泌產生復雜的影響，而與轉錄翻譯水平、能量代謝、細胞生長和繁殖密切相關的突變也可能影響纖維素酶的分泌[23]，Seiboth等[24]研究發現編碼半乳糖激酶基因的缺失雖不會影響半乳糖的代謝和里氏木霉在含乳糖培養基上的生長情況，但其基因缺失將對里氏木霉纖維素酶的產量產生極大影響，這表明半乳糖激酶基因的轉錄和纖維素酶產量密切相關。在JNDY-13中，半乳糖激酶基因的突變發生在非編碼區，其中18 個堿基（GGGTTAAAAAGCGACTCAC）代替半乳糖激酶基因454 bp處的“G”被插入，這可能是其纖維素酶活力發生改變的原因。

2.3 纖維素酶高產菌株的產酶優化

2.3.1 產酶培養基優化

培養基的組分、配比和緩沖能力等都對微生物的生長和產酶具有重要的影響[13]。本研究中，在他人研究的基礎上[18]，根據篩選獲得的高產菌株特性，設計6因素5水平的正交試驗（表1）對培養基的組分（乳糖、微晶纖維素、玉米漿、CaCl2、(NH4)2SO4、MgSO4）用量在搖瓶中進行優化，并進行極差分析。

表1 發酵培養基成分正交試驗設計與結果Table 1 Orthogonal array design with experimental results for optimization of fermentation medium

正交試驗結果表明，6 種培養基組分中玉米漿對產酶的影響最大，(NH4)2SO4次之，再次依次為乳糖、CaCl2、MgSO4和微晶纖維素。優化過的產酶培養基配方為：乳糖10 g/L、微晶纖維素10 g/L、玉米漿粉12 g/L、(NH4)2SO41.5 g/L、MgSO41.2 g/L、CaCl21.4 g/L、Mandels微量元素營養鹽1 mL/L、吐溫80 2 mL/L，pH 4.8。利用此培養基發酵產酶活力最高可達 2.64 IU/mL，高于原始培養基的產酶活力（2.21 IU/mL）。

2.3.2 5 L罐發酵條件優化

采用上述優化過的培養基，按照以下條件（裝液量為3 L，接種量10%，通氣量1 L/（L·min），攪拌轉速200 r/min，發酵溫度28 ℃，pH 5.0）進行實驗。首先通過單因素方法研究了對產酶影響較大的因素（通氣量、攪拌轉速、發酵溫度），而后通過正交試驗進一步優化發酵參數，并最終利用獲得的最優發酵條件對高產菌株JNDY-13進行分批發酵。由于纖維素酶的不同組分分別有不同的最佳產酶pH值，且主要集中在4.0～6.0之間，為保持實驗的一致性，本實驗中均采用pH 5.0進行研究[25-27]。

2.3.2.1 發酵溫度對產酶的影響

溫度對微生物的生長具有重要的影響，當發酵溫度較低時，菌體生長緩慢；而發酵溫度過高時雖菌體生長迅速但產酶量卻會偏低[28]。張曉煊等[29]研究發現里氏木霉在28～30 ℃培養可獲得較高的濾紙酶活，低于25 ℃或高于33 ℃時酶活力下降比較顯著。由于里氏木霉產酶的最佳溫度為28 ℃，而該菌株生長的最佳溫度為30 ℃[30]，因此本實驗以濾紙酶活為唯一標準，對發酵溫度28 ℃和30 ℃分別進行實驗，結果如圖5所示。當發酵溫度為28 ℃時產酶活力最高，可達4.33 IU/mL，這與文獻報道一致[27]。

圖5 發酵溫度對產酶的影響Fig. 5 Cellulase production curves at different fermentation temperatures

2.3.2.2 攪拌轉速對產酶的影響

保持其他參數不變，設定不同的攪拌轉速，以濾紙酶活為唯一指標對攪拌轉速進行優化。實驗發現，當初始攪拌轉速為600 r/min時，發酵液中的溶氧水平明顯增加，發酵前期菌體量迅速增加，至發酵中期時發酵液逐漸變清，表明菌絲大量死亡，且由圖6可知，當攪拌轉速為600 r/min時最高濾紙酶活僅為1.22 IU/mL，表明攪拌轉速太高時，雖然溶氧水平得以提高但是相應的剪切力也大大增加。發酵前期菌絲體強壯，而到了發酵中期時菌絲體老化對剪切力敏感，因此導致菌體大量死亡并使總酶活迅速降低[31]。當攪拌轉速為200 r/min時，溶氧自對數期起均處于較低水平，由于菌絲生長緩慢使得到達平臺期的時間明顯延長而不利于產酶。姜伯玲[32]發現當轉速較低時，發酵體系中的溶氧不足，從而影響菌絲體的生長代謝，這與本實驗結果相似。而當攪拌轉速為400 r/min時，既能基本保證菌體生長所需溶氧，又不會對菌絲造成太大的損傷，使得其最高酶活可達4.51 IU/mL。張素敏[33]對里氏木霉T306進行發酵條件優化時發現當攪拌轉速為400 r/min時，既能保證菌株的溶氧需求，又不會顯著損傷菌體，本研究中得到的結果與其報道一致。

圖6 攪拌轉速對產酶的影響Fig. 6 Cellulase production curves at different stirring speeds

2.3.2.3 通氣量對產酶的影響

溶氧水平對菌體生長和產酶都至關重要，且溶氧水平又與通氣量和攪拌轉速密切相關[34-35]。在攪拌轉速優化的基礎上，對通氣量進行進一步實驗。由圖7可知，當通氣量為2 L/（L·min）時，最高濾紙酶活可達4.44 IU/mL；而當通氣量為1 L/（L·min）時，最高濾紙酶活為3.72 IU/mL。

圖7 不同通氣量下的發酵產酶曲線Fig. 7 Cellulase production curves at different ventilation fl ow rates

2.3.2.4 正交試驗優化發酵條件

表2 發酵條件正交試驗設計與結果Table 2 Orthogonal array design with experimental results for optimization of fermentation conditions

根據優化過的產酶培養基以及上述單因素試驗結果，設計正交試驗（表2）對發酵條件進行優化。結果表明最佳發酵條件為發酵溫度28 ℃、攪拌轉速400 r/min、通氣量2 L/（L·min）、pH值恒定為5.0。發酵溫度對產酶影響最大，其次是攪拌轉速，再次是通氣量。根據發酵培養基成分以及發酵條件優化結果，對里氏木霉JNDY-13進行分批發酵，結果如圖8所示，在最優條件下進行分批發酵最高濾紙酶活可達4.74 IU/mL，最高菌體量可達8.91 g/L，且培養基中的乳糖在前36 h即消耗殆盡。

圖8 分批發酵結果Fig. 8 Time courses of fed-batch fermentation

2.3.3 流加發酵

圖9 流加發酵產纖維素酶Fig. 9 Production of cellulase through fed-batch fermentation

采用最優條件進行流加發酵，即自36 h起，每12 h流加一次乳糖和(NH4)2SO4的混合溶液（碳氮比10∶1），發酵過程中補充乳糖的總量不超過50 g/L。由圖9可知，流加發酵時最高濾紙酶活可達5.40 IU/mL，菌體量最高可達9.19 g/L。將流加發酵結果與分批發酵結果對比發現，二者纖維素酶產量的最高點都集中在發酵前期以及中期，而到發酵中后期產酶量均逐漸下降。這一現象表明本實驗獲得的最佳發酵條件相對較適合菌體生長與產酶，但仍未達到最佳要求，這可能與發酵中期發酵罐中菌體生長情況和蛋白酶的大量分泌有關。下一步工作中，可篩選蛋白酶分泌水平較低的高產菌株，并對發酵中期發酵罐中的各種因素如溶氧水平、菌體密度、活菌比例、殘糖和培養基中蛋白酶活力等進行具體分析，指導進一步的發酵優化。

3 結 論

本實驗通過常溫室壓等離子體技術誘變里氏木霉RUT-C30，成功獲得1 株纖維素酶高產菌株JNDY-13，搖瓶初篩其最高濾紙酶活可達2.21 IU/mL，為出發菌株里氏木霉RUT-C30的2.21 倍。

為研究高產突變株JNDY-13的遺傳變化，進行全基因組測序。測序結果顯示共有752 個突變，其中18 個為水解酶類，34 個為合成酶類，20 個為激酶，52 個與能量代謝相關，73 個與物質運輸相關，38 個與轉錄和翻譯相關，8 個與生長相關，399 個為假定蛋白，其中110 個與其他功能相關。發現752 個突變中含有105 個點突變，336 個為堿基缺失，165 個為堿基插入，以及99 個為混合突變。

突變菌株經培養基優化及發酵條件優化，最高酶活可達5.40 IU/mL，菌體量最高可達9.19 g/L，且經10 次傳代該菌株依然有較高纖維素酶活力。