瓦倫西亞橘烯生物轉化生成圓柚酮

李 曉，范 剛*，任婧楠，張璐璐，潘思軼

（華中農業大學食品科學技術學院，環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

圓柚酮為倍半萜烯類化合物，屬雅檻藍烷系的雙環倍半萜酮[1]。圓柚酮在低濃度時表現出濃郁的柚子香氣，并帶有甜橙、木香香韻，但味苦，其氣味閾值較低，僅為1 μg/L[2]。圓柚酮因具有宜人的柑橘香氣而受到人們的關注，自其被發現以來，關于圓柚酮的天然分布、晶體結構及其多種立體異構體的香味特征，都得到廣泛的研究[3-4]。圓柚酮價格十分昂貴，由于它在天然產物中含量很低，而且其具有立體異構體，幾乎無法分離得到，且提取成本很高，所以圓柚酮的提取及應用受到很大限制[5-6]。

作為柚味香精的重要成分，圓柚酮常被用于食品飲料及日化產品中，其在飲料中的用量一般為2～6 mg/L；在日化香精配方中，圓柚酮與其他柑橘類精油（如苦橙油、香檸檬油等）配合使用，可以增加產品柑橘香調[7]。近年來，國外關于圓柚酮的研究更加側重于生理作用及提取工藝。有研究報道，從益智藥材中分離得到的圓柚酮，在抗實驗性胃潰瘍、抑制脂多糖活化等方面具有顯著活性[8]。也有研究發現圓柚酮對玉米象和米象2 種害蟲具有驅蟲效果[9]。此外，圓柚酮還對地下白蟻具有明顯的驅避和毒性作用，同時可以降低白蟻體細胞的脂肪比例[10-12]。謝建春等[13-14]發現蒸餾萃取法及延長蒸餾時間可以提高柚皮油中圓柚酮的含量。除物理方法外，圓柚酮還可以通過化學合成的方法進行制備。目前主要的合成方法是使用瓦倫西亞橘烯作為底物，使用重鉻酸鹽進行氧化，或在叔丁基過氧化氫存在下使用催化劑進行氧化，通過三步反應轉化得到圓柚酮[15-17]。

圖1 瓦倫西亞橘烯轉化為圓柚酮Fig. 1 Conversion of valencene to nootkatone

采用化學合成法生產圓柚酮由于使用大量重金屬催化劑，如鉻酸叔丁酯、三氧化鉻等，會對環境造成嚴重的污染，并存在一定的安全問題，且不屬于天然香料，目前已有學者采用微生物及其代謝酶進行轉化生產研究（圖1）[18-21]。歐洲和美國食品法規明確規定，采用化學合成法得到的圓柚酮產品不能作為一種天然香料進行銷售和使用，而通過微生物轉化生產的香料被認為是天然的。GB 29938—2013《食品用香料通則》規定通過酶法或微生物法工藝生產的香料也被認為是天然的。近些年來，隨著人們食品安全意識的提高，人們更加傾向選擇天然物質作為添加劑，這鼓勵了利用生物轉化法生產天然香料的研究工作[22]。目前國內外有關瓦倫西亞橘烯生物轉化生產圓柚酮的研究還很少。本研究旨在通過比較3 株不同微生物菌種轉化瓦倫西亞橘烯生產圓柚酮的效果，篩選適于轉化瓦倫西亞橘烯生產圓柚酮的菌種，優化發酵培養基成分，增加瓦倫西亞橘烯轉化生成圓柚酮的轉化量，并提高其轉化率，降低天然香料圓柚酮的生產成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）、毛霉（Mucor sp.）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica） 上海生物網菌種保藏中心（RCCC）。

無水乙醇、磷酸、吐溫80（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；瓦倫西亞橘烯（＞70.0%） 美國Sigma公司；圓柚酮（＞97.0%） 日本東京化成工業株式會社。

1.1.2 培養基

馬鈴薯瓊脂（PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min，冷卻放置斜面。

麥芽汁瓊脂培養基：麥芽汁150 mL，瓊脂3 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。高溫滅菌后倒平板。

蛋白胨培養基：1.5%蔗糖，1.5%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.1% K2HPO4，0.05% KCl，0.001% FeSO4·7H2O，蒸餾水，pH 7。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

YPD培養基：2%葡萄糖，1%酵母膏，2%蛋白胨。

1.2 儀器與設備

6890N/5975B氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用儀 美國Agilent公司；萃取纖維頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）、固相微萃取頭（solid phase microextraction，SPME） 美國Supelo公司；DF-101s集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鄭州長城科工貿有限公司；25×16型血球計數板 上海求精生化試劑儀器有限公司；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

以無水乙醇為溶劑，分別配制200、400、600、800、1 000 mg/L的標準圓柚酮溶液，采用SPME-GC-MS檢測分析，以峰面積為縱坐標、圓柚酮質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程為Y=380 602X+240 216，R2=0.992 6。

1.3.2 菌種活化

凍干菌種管冷藏保存在5～10 ℃。用無菌吸管吸取0.3～0.4 mL生理鹽水，滴入管內，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解成懸浮狀液體。取約0.2 mL菌懸液，轉接于培養基平板上，在每個平板的底部做好標記，30 ℃過夜培養長出細菌單菌落。將平板用封口膜封好置于4 ℃冰箱中備用。

將A. niger、Mucorsp.接種于PDA培養基斜面上，Y. lipolytica接種于麥芽汁瓊脂培養基上，30 ℃培養3～7 d，待孢子長出后置于4 ℃冷藏保存。每個月用斜面培養基轉接活化1 次。

1.3.3 孢子懸浮液制備與底物預處理

從傳代的菌種培養基中挑取部分菌絲接種于滅菌的斜面培養基上，30 ℃恒溫培養4 d。以適量無菌水從生長良好的斜面培養基上洗下孢子，在搖床上30 ℃、200 r/min振蕩4 h，打散孢子。然后以體積分數0.01%吐溫80為接種劑調整孢子懸浮液濃度為106～107個/mL[14,23]。

底物瓦倫西亞橘烯用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存。

1.3.4 菌體預培養與底物的轉化

1.3.4.1A. niger孢子懸浮液轉化

取1 000 μL的A. niger孢子懸浮液接種于裝有50 mL蛋白胨培養基（pH 7.0）搖瓶中。30 ℃、100 r/min培養3 d。然后加入瓦倫西亞橘烯（0.92 mg/mL），接著培養4 d。

1.3.4.2Mucorsp.孢子懸浮液轉化

取1 000 μL的Mucorsp.孢子懸浮液接種于裝有50 mL蛋白胨培養基的搖瓶中，30 ℃、100 r/min培養7 d。然后加入瓦倫西亞橘烯（0.92 mg/mL），30 ℃進一步培養4 d。

1.3.4.3Y. lipolytica孢子懸浮液轉化

取1 000 μL的Y. lipolytica菌種懸浮液接種于裝有50 mL的YPD培養基搖瓶中，30 ℃、100 r/min培養3 d。然后加入瓦倫西亞橘烯（0.92 mg/mL），30 ℃繼續培養4 d。然后10 000 r/min離心10 min，取上清液，檢測轉化產物。所有實驗同時設置底物空白對照（只添加底物，不添加菌種）和菌株空白對照（只添加菌種，不添加底物），重復3 次。

1.3.5 轉化產物分析

準確量取5 mL離心后的發酵液移入20 mL鉗口樣品瓶中，加入1.8 g NaCl以促進揮發性成分的揮發，用聚四氟乙烯隔墊密封，于磁力攪拌器上40 ℃加熱平衡15 min后，通過隔墊插入己活化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（270 ℃活化1 h），推出纖維頭，頂空吸附40 min后，插入GC-MS進樣口解吸5 min，分別測定黑曲霉轉化瓦倫西亞橘烯在24、48、72 h和96 h時的轉化產物。

GC條件：6890N型氣相色譜儀，毛細管柱為HP-5（30 m×250 μm，0.25 μm），程序升溫，起始溫度40 ℃，保持3 min，以3 ℃ /min升至160 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升至220 ℃，保持3 min。進樣口溫度250 ℃。MS條件：5975B質譜儀，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子電離源，電子能量70 eV，質量范圍為45～550 u[24]。

定性分析：采用GC-MS聯用儀進行分析鑒定，并利用C6～C30正構烷烴的保留時間計算各個色譜峰的保留指數。分析結果運用計算機譜（NIST05/WILEY7.0）進行初步檢索和資料分析，再結合文獻的保留指數進行比對并進行人工譜圖解析，確認揮發性物質的各個化學組成。

定量分析：采用外標法進行定量圓柚酮。其他產物定量使用環己酮作為內標，以環己酮的峰面積與香氣物質的峰面積進行對比計算，以此定量。成分含量及轉化率的計算見下式：

1.3.6 解脂耶氏酵母發酵培養基組成的優化

1.3.6.1 發酵培養基中碳源、氮源、無機鹽對轉化的影響

以YPD培養基為基礎，并分別以30 g/L質量濃度的葡萄糖、麥芽糖、甘油、可溶性淀粉、蔗糖、β-環糊精和α-乳糖作為唯一碳源，考察碳源種類對產物圓柚酮轉化率的影響。

以YPD培養基為基礎，分別以20 g/L酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、(NH4)2SO4和NH4Cl作為單一氮源，考察氮源種類對產物圓柚酮轉化率的影響。

以Y P D培養基為基礎，分別添加0.5 g/L的ZnSO4·7H2O、CaC12、MnSO4·H2O、CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O，考察無機鹽對圓柚酮轉化率的影響。

1.3.6.2 培養基成分正交優化

表1 培養基正交設計試驗L9（33）Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in L9 (33) orthogonal array design g/L

通過對培養基碳源、氮源和無機鹽的考察，確定最適碳源、氮源和無機鹽，設計3因素3水平正交試驗，如表1所示。以α-乳糖、蛋白胨和FeSO4·7H2O質量濃度為變量、以圓柚酮產量為指標優化培養基組成。

1.4 數據統計與分析

由3 次平行實驗測定得到的各實驗平均值及標準偏差采用Microsoft Office Excel 2010進行計算。不同組別間的顯著性采用SPSS Statistics 20.0軟件進行F值檢驗及單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 黑曲霉轉化瓦倫西亞橘烯的產物分析

表2 黑曲霉轉化瓦倫西亞橘烯的產物Table 2 Conversion products of valencene by A. niger mg/L

柑橘的香氣物質主要由單萜類和單萜醇組成，而酚類化合物、去甲異戊二烯類化合物和其他揮發物對柑橘香氣也起著重要的作用[25]。如表2所示，黑曲霉轉化瓦倫西亞橘烯的產物包括D-檸檬烯、α-松油醇、香芹醇、香芹酮、胡椒酮、水芹醛、β-欖香烯、α-紫羅蘭酮、α-香附酮9 種物質。在最初的24 h，產物有D-檸檬烯、香芹醇、香芹酮、水芹醛、其中D-檸檬烯質量濃度最高，為（14.74±2.55）mg/L。在接下來的48 h，產物香芹酮和水芹醛含量繼續增加，而D-檸檬烯、香芹醇含量減少，同時還有5 種新的物質被檢出，包括α-松油醇、胡椒酮、β-欖香烯、α-紫羅蘭酮、α-香附酮；當轉化72 h時，檢測不出香芹醇、α-紫羅蘭酮和α-香附酮。α-香附酮為圓柚酮的同分異構體，其在96 h也被檢出。最近研究發現，葡萄基因組中含有一大類單萜烯合成酶和倍半萜合成酶，其中許多已被確定能夠生產芳香單萜醇，如香葉醇、芳樟醇和α-松油醇等[26-27]。轉化生成產物中，檸檬烯是除圓柚酮外產量最高的產物，據文獻[28]報道，檸檬烯在進行微生物轉化時，主要發生環氧化反應以及水解反應，其氧化可產生l、2位環氧化物質，在發生水解反應時，主要水解產物為檸檬烯-1,2-二醇；在6位發生羥基化反應以及羰基化反應時，其產物主要為香芹酮以及二氫香芹酮；在8位發生氧化反應時，產物為松油醇。瓦倫西亞橘烯微生物轉化過程中，α-松油醇、香芹酮等可能為檸檬烯的代謝產物。

圖2 黑曲霉轉化瓦倫西亞橘烯為圓柚酮的轉化量以及轉化率Fig. 2 Amount and conversion rate of nootkatone biotransformed by A. niger

如圖2所示，在24 h內，圓柚酮有少量生成，轉化量達到（4.66±2.75）mg/L；在24～48 h，圓柚酮大量生成，其質量濃度達到（140.94±30.26）mg/L；當轉化至72 h，圓柚酮產量開始降低，可能是由于產物不斷生成積累使得轉化量降低，轉化圓柚酮受到抑制；當轉化至96 h，產物轉化量持續降低，轉化量為（91.97±9.80）mg/L。在轉化過程中，圓柚酮的轉化率最高達到（15.32±3.29）%。曲霉的生物活性很高，有關曲霉生物轉化萜類物質的研究，也有一些報道。Furusawa等[18]發現黑曲霉（Aspergillus niger）轉化瓦倫西亞橘烯5 d后，并未發現生成圓柚酮。Rocha等[29]研究發現土壤曲霉（Aspergillus terreus）可以對倍半萜內酯生物轉化產生一種罕見的衍生物，表明土壤真菌可能在倍半萜內酯的生物轉化中發揮作用，從而導致它們的化學結構發生異常變化。

2.2 毛霉轉化瓦倫西亞橘烯的產物分析

表3 毛霉轉化瓦倫西亞橘烯的產物Table 3 Conversion products of valencene by Mucor sp.mg/L

毛霉能對許多自然物質進行生物轉化[30]。如表3所示，毛霉轉化瓦倫西亞橘烯的產物包括D-檸檬烯、α-松油醇、香芹醇、香芹酮、水芹醛、紫蘇醇、肉豆蔻醛和α-香附酮8 種物質，這與黑曲霉轉化產物有所相同。在最初的24 h，瓦倫西亞橘烯被轉化為右旋萜二烯（D-檸檬烯），其質量濃度為（15.61±4.34）mg/L。在2 4～4 8 h，D-檸檬烯含量開始降低，質量濃度為（1.6 2±0.3 7）m g/L，同時新生成5 種產物，包括α-松油醇、香芹醇、香芹酮、紫蘇醇、α-香附酮；當轉化至72 h，α-香附酮含量持續增加，D-檸檬烯含量保持穩定，另外，α-松油醇、香芹醇、香芹酮、紫蘇醇含量降低，同時得到一種新的產物肉豆蔻醛（（5.52±2.69）mg/L）；在轉化至96 h，各種物質的含量趨于穩定，檢出新的物質水芹醛（（7.09±2.59）mg/L），未檢測到肉豆蔻醛。檸檬烯是除圓柚酮外產量最高的產物，檸檬烯在7位發生甲基的羥基化反應時，可以得到產物紫蘇醇。瓦倫西亞橘烯微生物轉化過程中，α-松油醇、香芹醇、香芹酮、紫蘇醇等可能為檸檬烯的代謝產物。

圖3 毛霉轉化瓦倫西亞橘烯為圓柚酮的轉化量以及轉化率Fig. 3 Amount and conversion rate of nootkatone biotransformed by Mucor sp.

如圖3所示，在初始24 h，圓柚酮有少量生成，產物轉化量達到（3.16±4.31）mg/L；在48～72 h，圓柚酮大量生成，其質量濃度達到（112.73±23.04）mg/L；當轉化至72 h，圓柚酮轉化量持續增加，底物瓦倫西亞橘烯繼續轉化，圓柚酮轉化量達到（137.67±14.02）mg/L；當轉化至96 h，產物含量基本保持穩定，轉化量為（142.18±30.90）mg/L。在轉化過程中，圓柚酮的轉化率最高達到（15.45±3.36）%，其轉化能力和黑曲霉差不多。毛霉能夠選擇性地將瓦倫西亞橘烯轉化為圓柚酮，Furusawa等[31]發現從苔類植物黏附的土壤中分離出的一株菌種，經鑒定為毛霉，其轉化瓦倫西亞橘烯生成4 種轉化產物，其中圓柚酮的轉化率達82%，本實驗轉化率要低于其轉化率，可能是由于其所用菌株為自然分離，雖然和Mucorsp.同屬一個種，但生物轉化能力不同。

2.3 解脂耶氏酵母轉化瓦倫西亞橘烯的產物分析

如表4所示，解脂耶氏酵母對瓦倫西亞橘烯的轉化產物包括D-檸檬烯、α-松油醇、香芹醇、香芹酮、紫蘇醇、甲基丁香酚、石竹烯和α-香附酮8 種物質。在最初的24 h，檢出的產物為D-檸檬烯、α-松油醇、香芹酮、甲基丁香酚、石竹烯和α-香附酮，其中石竹烯質量濃度最高，達到（8.29±1.17）mg/L。在48～72 h，這6 種產物繼續積累，同時生成2 種新的物質，包括香芹醇（（13.53±1.71）mg/L）和紫蘇醇（（1.15±0.13）mg/L）；當轉化至72 h，所有轉化產物含量都有所降低，同時并未檢測到紫蘇醇，香芹酮質量濃度最低（（0.22±0.12）mg/L）；轉化至96 h，D-檸檬烯、α-松油醇、香芹醇和石竹烯含量繼續降低，α-香附酮質量濃度有所增加（（8.63±1.02） mg/L），未檢測到香芹酮，紫蘇醇和甲基丁香酚。瓦倫西亞橘烯微生物轉化過程中，檸檬烯在48 h產量很高，α-松油醇、香芹醇、香芹酮、紫蘇醇等可能為檸檬烯的代謝產物。

表4 解脂耶氏酵母轉化瓦倫西亞橘烯的產物Table 4 Conversion products of valencene by Y. lipolytica mg/L

圖4 解脂耶氏酵母轉化瓦倫西亞橘烯為圓柚酮的轉化量以及轉化率Fig. 4 Amount and conversion rate of nootkatone biotransformed by Y. lipolytica

如圖4所示，在初始24 h，圓柚酮有大量生成，產物轉化量達到（155.75±12.64）mg/L；在48～72 h，圓柚酮持續生成，其轉化量達到（252.52±15.79）mg/L；當轉化至72 h，圓柚酮含量保持穩定，但有所降低；當轉化至96 h，產物含量基本保持穩定，轉化量為（249.62±17.23）mg/L。在轉化過程中，圓柚酮轉化率最高達到（27.45±1.72）%，其轉化能力與黑曲霉和毛霉相比，轉化率更高。Palmerín-Carre等[22]利用Y. lipolytica2.2ab菌株，進行圓柚酮轉化實驗，通過加入3.2 g/L底物，在雙相系統條件下對瓦倫西亞橘烯進行轉化，最終得到圓柚酮轉化量為216.9 mg/L，在單一有機相的條件下對瓦倫西亞橘烯進行轉化，其轉化量達217.4 mg/L。與本實驗相比，加入0.92 g/L的底物，通過解脂耶氏酵母轉化生成圓柚酮的含量略高于其研究，主要原因可能是降低底物質量濃度，減少了底物的抑制作用。在Wriessnegger等[32]的研究中，畢赤酵母（Pichia pastoris）被用作全細胞生物催化劑，從橙子的豐富香氣化合物瓦倫西亞橘烯中生產圓柚酮，并發現畢赤酵母醇脫氫酶和截短的羥基-甲基戊二酰輔酶A還原酶顯著增強圓柚酮的產量（208 mg/L）。利用酶進行合成轉化瓦倫西亞橘烯也有相應的研究。另外，阿拉斯加雪松酵母中瓦倫西亞橘烯合成酶和瓦倫西亞橘烯氧化酶可以共表達轉化瓦倫西亞橘烯生成圓柚酮（144 μg/L），在不采用雙相介質（正十二烷為有機相）的條件下，僅生成3 μg/L的圓柚酮[33]，其轉化量遠低于本實驗。在單一水相的條件下，菌種Phanerochaete chrysosporium轉化瓦倫西亞橘烯生成圓柚酮產量達110.3 mg/L，在雙相體系條件下，單胞菌Botryodiplodia theobromae轉化瓦倫西亞橘烯生成圓柚酮產量達239.7 mg/L[22]，而本研究發現解脂耶氏酵母的轉化能力要高于這兩株菌。Gavira等[34]利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），采用一種基因挖掘的方法，從高等植物中篩選出4 種潛在的P450酶，并在重組酵母微粒體中篩選相應的酶，生物轉化實驗產生β-圓柚酮和圓柚酮，同時，其隨著底物質量濃度的增加而降低，本實驗也得到相同的結果。

2.4 解脂耶氏酵母發酵培養基組成的優化結果

上述實驗結果顯示，解脂耶氏酵母的轉化能力要明顯高于黑曲霉和毛霉，故選取解脂耶氏酵母菌株進行發酵培養基成分的優化。

2.4.1 發酵培養基中碳源對轉化效果的影響

由圖5A可知，選取的7 種碳源均可以促進菌種生長，但其轉化瓦倫西亞橘烯生成圓柚酮的轉化量不同。其中α-乳糖最有利于瓦倫西亞橘烯轉化生成圓柚酮，因為乳糖是比較易被微生物利用的糖，是促進細胞快速生長的一種有效的糖類物質。α-乳糖作為碳源進行菌種轉化時，其轉化圓柚酮產量達到228.16 mg/L，轉化率達到24.80%。相較于其他幾種碳源，其轉化效率更高，其中蔗糖的轉化效果與α-乳糖相差無幾，其轉化圓柚酮質量濃度達到207.47 mg/L，轉化率為22.55%。糊精相較于其他6 種碳源，其轉化效率最低，轉化生成圓柚酮的量僅為8.98 mg/L，其轉化率也僅為0.98%。

由圖5B可知，在實驗選取的5 種氮源進行菌種轉化的過程中，蛋白胨最有利于瓦倫西亞橘烯轉化生成圓柚酮。其在同等質量濃度的氮源條件下，其轉化瓦倫西亞橘烯為圓柚酮的量最高，其轉化生成圓柚酮質量濃度達到367.09 mg/L，轉化率達到39.90%。在利用蛋白胨為唯一氮源的條件下，其轉化的能力要明顯高于其他4 種氮源，其中包括2 種無機氮源。

無機鹽離子大部分作為酶的輔基和激活劑，維持細胞結構和生物大分子的穩定性，通過控制細胞的氧化還原電位，調節和維持細胞的滲透壓平衡，并作為能量來源。通常在低濃度條件下，無機鹽能夠促進微生物生長和產物合成，而在高濃度時常表現出明顯的抑制作用[35]。P、S、K、Mg等元素可以參與細胞的組成，并具有能量轉移、細胞透性調節等功能。如圖5C所示，在培養基中添加少量的Fe2+、Cu2+后對于轉化具有促進作用，可能是因為Fe2+、Cu2+是P450酶系需要的離子，P450酶能將Fe2+氧化得到電子[36]。由于Fe2+明顯的促進作用，其轉化圓柚酮的量達到（435.95±24.40）mg/L，轉化率達到（47.38±2.65）%，因此，后續實驗選取其作為金屬鹽進行培養基優化。

圖5 碳源（A）、氮源（B）以及無機鹽（C）對圓柚酮轉化量以及轉化率的影響Fig. 5 Effects of different carbon sources (A), nitrogen sources (B) and metal ions (C) on conversion rate of nootkatone

2.4.2 培養基正交試驗結果

如表5所示，從轉化結果以及轉化率來看，FeSO4·7H2O、α-乳糖和蛋白胨3 個因素對瓦倫西亞橘烯轉化生成圓柚酮轉化量的影響順序為：FeSO4·7H2O＞α-乳糖＞蛋白胨。均值K代表同一因素不同水平的重要性，其中K值越高，對此因素的影響越大[37]。通過各因素組合，發現試驗7最有利于解脂耶氏酵母轉化瓦倫西亞橘烯為圓柚酮，其組合為α-乳糖40 g/L、蛋白胨15 g/L、FeSO4·7H2O 0.6 g/L，圓柚酮轉化量達到（457.32±76.11）mg/L，圓柚酮轉化率達到49%。利用初始YPD培養基培養解脂耶氏酵母轉化生成圓柚酮的轉化量僅為（252.52±15.79）mg/L，轉化率為（27.45±1.72）%，優化培養基后，發酵培養基的轉化率提高了21.55%。可能是由于初始YPD培養基是適合幾乎所有酵母生長的培養基，但是對解脂耶氏酵母轉化瓦倫西亞橘烯并不是很適合，通過正交試驗，可以得到其最適合轉化的培養基成分。

表5 培養基正交試驗的轉化結果Table 5 Orthogonal array design with experimental results

3 結 論

本實驗利用SPME-GC-MS分析3 株真菌轉化瓦倫西亞橘烯的轉化產物，共檢出14 種轉化產物，其中，D-檸檬烯、α-松油醇、香芹醇、香芹酮和

α-香附酮在3 種菌株的轉化產物中均被檢出。3 種菌株都可對瓦倫西亞橘烯進行轉化并生成圓柚酮，其中解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）轉化能力最強，在48 h時生成（252.52±15.79）mg/L圓柚酮，轉化率為（27.45±1.72）%，表現出良好的轉化能力。對發酵培養基進行優化后，圓柚酮轉化量達到（457.32±76.11）mg/L，圓柚酮轉化率達到49%，和未優化的發酵培養基相比，轉化率提高了21.55%。