解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶在馬蘇里拉干酪中的應用

騰軍偉，劉振民，蘇米亞，高紅艷，鄭遠榮，李 柳，鄭 喆，張 健，楊貞耐,*

（1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京工商大學，北京 100048；2.乳業生物技術國家重點實驗室，上海乳業生物工程技術研究中心，光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海 200436）

凝乳酶（EC 3.4.23.4）是干酪加工時添加于牛乳中使乳液凝固的關鍵性酶[1]，其凝乳及蛋白水解活力對干酪得率、質構和特殊風味有著非常重要的影響[2-5]。傳統上凝乳酶是從牛犢皺胃中鹽浸提取獲得。近年來隨著市場需求逐年增大和小牛宰殺量持續下降，傳統凝乳酶的供應已無法滿足干酪生產的需求，使得進一步開發凝乳酶成為目前乳品科技領域的研究熱點之一。微生物具有生長不受氣候和地域的限制，來源廣泛且發酵容易控制，生長周期短、產酶量大、經濟效益高等優勢，是目前最有發展潛力的酶制劑來源[6-9]。在產凝乳酶的微生物中，細菌具有較真菌體積小、繁殖快、產物易于提取分離，適合高密度培養增殖產酶等優勢[10-11]。本研究前期從中國傳統酒曲中篩選得到1 株高產凝乳酶的優勢細菌菌株，并鑒定命名為解淀粉芽孢桿菌GSBa-1（CGMCC No.13745）[12]；進一步通過優化該菌株發酵產凝乳酶條件，使得其產酶活力得到較大幅度提升[13-14]；對該菌株發酵液進行提取純化凝乳酶，研究表明該凝乳酶具有優良的酶學性質[15]，可進一步應用于干酪加工。

干酪營養非常豐富，有“奶黃金”的美稱[16]。其中馬蘇里拉干酪，因其具有拉絲性能，在披薩中得到廣泛應用，在中國市場占有量很大。本研究將解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶應用于馬蘇里拉干酪中，并與商品凝乳酶進行比較分析，研究該菌株凝乳酶是否具備應用于馬蘇里拉奶酪中的潛力，以期改善國產干酪大規模工業化生產依賴進口凝乳酶的現狀，為該凝乳酶應用于干酪工業化生產提供理論和技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛奶（脂肪質量分數3.82%，蛋白質量分數3.62%，乳糖質量分數3.99%） 市售；發酵劑：XZ3303+QH27-1，由北京工商大學食品學院乳品實驗室提供；商品凝乳酶 丹麥科漢森有限公司。

1.2 儀器與設備

干酪槽 德國GEA公司；T25 Ultra-Turrax勻漿器德國IKA公司；Texture ProCTV1.8 Build31質構儀 美國Brookfield公司；U-3900紫外分光光度計 日本Hitachi公司；S7130氨基酸分析儀 德國Sykam公司；DVBCAR-PDMS手動固相微萃取進樣器 美國Supelco公司；Kjeltec8100凱氏定氮儀 美國FOSS公司；7890A-7000氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用分析儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 馬蘇里拉干酪的制作流程

原料乳→過濾→7 2 ℃，1 5 s巴氏殺菌→冷卻至32 ℃→加入發酵劑和輔助發酵劑（7.0～8.0（lg（CFU/mL））→32 ℃靜置培養30 min→添加凝乳酶（10 000 SU/L（以牛乳計），中速攪拌5 min；其中菌株GSBa-1凝乳酶活力為1.54×105SU/g，商業凝乳酶活力為3.16×105SU/g）→32 ℃保溫靜置45 min→切割凝塊（8 mm×8 mm×8 mm）→32 ℃保溫靜置15 min→熱燙，30 min內緩慢升溫至50 ℃→排乳清（pH 5.2～5.4）→重疊堆積，38 ℃每15 min翻轉1～2 次→粉碎平鋪于干酪槽底→70 ℃混揉→成形→浸漬鹽化2 d（3%鹽水）→真空包裝→4 ℃成熟1 個月→馬蘇里拉干酪

以商品凝乳酶制作的干酪為對照組干酪（A），以解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶制作的干酪為實驗組干酪（B）。

1.3.2 培養基的配制

M17培養基的配制參考楊亞威等[17]方法。

1.3.3 干酪理化成分的測定

1.3.3.1 干酪得率

在干酪制作過程中，準確稱量并記錄原料乳、發酵劑、食鹽和干酪成品質量，用于干酪得率的計算。由干酪得率可以得知干酪的生產效益并能反映干酪生產時的各工藝參數經濟合理性，在衡量提高產率工藝改進有效性等方面提供依據。計算方法見式（1）：

1.3.3.2 干酪水分含量

根據GB 5009.003—2010《食品中水分的測定》測定干酪水分質量分數。

1.3.3.3 干酪蛋白質量分數

根據AOAC920.123（1990）凱氏定氮法測定干酪蛋白質量分數。

1.3.4 干酪理化指標的測定

1.3.4.1 干酪pH值

準確稱取干酪樣品10 g，磨碎后加入12 mL經50 ℃溫浴的蒸餾水，Ultra-Turrax勻漿器處理1 min，將樣品充分勻漿后，放置在50 ℃水浴中保溫處理30 min，于5 000×g離心15 min（20 ℃），去除脂肪層，測定下層溶液的pH值。

1.3.4.2 干酪微生物指標

分別在干酪成熟的第0、5、10、15、20、25、30天取樣測定樣品的活菌數。準確稱取干酪樣品11 g加入到99 mL 2 g/100 mL檸檬酸鈉溶液（40 ℃）中，勻漿器處理2 min，使樣品充分勻漿，用0.9%生理鹽水逐級稀釋到適當倍數。吸取50 μL稀釋液涂布于事先倒好的M17瓊脂平板上，培養2～3 d后對乳酸乳球菌進行計數。

1.3.4.3 干酪pH 4.6可溶性蛋白

稱取20 g干酪樣品，磨碎后加入40 mL經50 ℃溫浴的蒸餾水，勻漿器處理2 min，將樣品充分勻漿，放置于40 ℃水浴中保溫1 h。20 ℃、3 000×g離心15 min，濾除脂肪，用乙酸調節pH 4.6，離心后取上清液冷凍干燥成粉末，備用；高效液相色譜上樣條件參考趙笑等[18]方法。

1.3.4.4 干酪氨基酸成分

利用氨基酸分析儀測定三氯乙酸（12%）可溶性氮溶液中的游離氨基酸含量。交換柱用標準氨基酸混合物矯正，在樣品分析中添加亮氨酸為內標。在570 nm波長處，采用茚三酮柱后衍生化法測定氨基酸含量，其中脯氨酸于440 nm波長處檢測。

1.3.4.5 干酪質構特性

用質構分析儀對干酪樣品進行全質地剖面分析。去掉干酪樣品上下及邊緣約5 mm的部分，在同一水平線上用取樣器取正方體樣品，使樣品長寬高均為1.5 cm。測試前將樣品在室溫條件下放置30 min，使其溫度均衡。測試參數設定如下：測試前速率2.0 mm/s，測試速率0.4 mm/s，返回速率0.4 mm/s，循環2 次，數據頻率20 點/s，觸發點負載5 g，壓縮比50%，探頭型號TA-AACC3。每個樣品平行3 次，取平均值。相應質構參數及定義見表1。

表1 干酪質構測試中的主要參數及定義Table 1 The main test parameters of cheese texture and their definitions

1.3.4.6 干酪成熟中微觀結構

樣品處理方法參考趙笑等[18]方法。

1.3.5 干酪風味物質的測定

準確稱量5 g干酪樣品，磨碎后放于30 mL萃取瓶中，加蓋密封置于水浴鍋（50 ℃）中平衡20 min，固相微萃取50 ℃吸附40 min后插入GC進樣口250 ℃解吸5 min。

GC條件：程序升溫：設置初始溫度為40 ℃，此溫度下保持3 min，然后以5 ℃/min升溫到200 ℃，保持0 min，再以10 ℃/min升溫到250 ℃，保持3 min。之后運行3 min。載氣（He），恒定流速1.2 mL/min，進樣口溫度250 ℃，分流比5∶1。

MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質量掃描范圍m/z40～250。

1.3.6 干酪性能指標測定

1.3.6.1 保形性實驗

將內徑為15 mm的取樣刀縱向插入樣品，深度超過15 mm，旋轉180°以上，抽出取樣刀，取下小樣，截取15 mm長度，得到底面直徑15 mm、高15 mm的圓柱體樣品，將樣品置于高壓滅菌釜中，121 ℃加熱20 min，測量殘留樣品的高度，樣品平行3 次，計算保形性。計算見式（2），結果取整數。

1.3.6.2 拉絲性實驗

干酪拉絲性能的測定參考RHB 507—2015《匹薩用拉絲性干酪感官評鑒細則》。當干酪樣品溫度達到75 ℃[19]后，取一塊觀察并測量其拉絲長度和記錄拉絲根數，樣品平行3 次。

1.3.7 干酪感官評定

對成熟30 d的馬蘇里拉干酪進行取樣，并進行感官評定。評定方法參考GB 5420—2010《干酪》、GB 25192—2010《再制干酪》和GB/T 13868—2013《感官分析 建立感官分析實驗室的一般導則》，并稍有改動。將待檢樣品切成2 mm薄片，采用評分法。由經食品感官評鑒培訓的10 人小組對實驗組和對照組干酪進行評分。具體標準見表2。

表2 馬蘇里拉干酪感官評定指標及評分標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of Mozzarella cheese

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 干酪理化成分分析

表3 Mozzarella干酪理化成分Table 3 Chemical composition of Mozzarella cheese%

由表3可以看出，由于添加不同的凝乳酶，干酪理化成分稍有差異。添加菌株GSBa-1凝乳酶的干酪得率和水分質量分數略低于對照組干酪，而實驗組干酪的蛋白質量分數稍高于對照組，表明該菌株GSBa-1凝乳酶對馬蘇里拉干酪的理化成分沒有顯著影響（P＞0.05）。

2.2 干酪其他理化指標測定結果

2.2.1 干酪pH值

由圖1可知，對照組和實驗組干酪在0～10 d期間，pH值下降速率較快，這是因為大量乳酸菌分解利用干酪中殘存的乳糖產生乳酸導致pH值迅速下降。而在干酪成熟中后期，隨著乳糖逐漸被耗盡，又隨時間的延長，乳蛋白發生水解游離出的NH+與乳酸結合，引起pH值有小幅上升的趨勢。總體來看，2 組干酪在成熟過程中，由于添加不同的凝乳酶導致干酪pH值變化差異較小。因此，菌株GSBa-1凝乳酶對干酪成熟過程中pH值變化沒有明顯影響。

圖1 干酪成熟期間的pH值變化Fig. 1 Changes in pH value during ripening of Mozzarella cheese

2.2.2 干酪成熟過程中發酵劑乳酸乳球菌的存活情況

圖2 馬蘇里拉干酪成熟過程發酵劑乳酸乳球菌的存活情況Fig. 2 Survival of Lactococcus lactis during ripening of Mozzarella cheese

由圖2可知，在0～15 d內對照組和實驗組干酪中的乳球菌菌落數均呈現緩慢增長，這是由于在成熟初期干酪中含有較多的乳糖，乳球菌可以利用乳糖生長繁殖。在之后的15～30 d，乳球菌菌落數開始減少，這是由于干酪中的乳糖不斷被利用而減少，乳球菌出現死亡或自溶現象。此外，乳酸菌可促進乳糖發酵，其自溶后釋放的各種蛋白酶，能加速干酪中蛋白質和脂肪等有機物降解，賦予干酪良好的風味和品質[20]。在整個干酪成熟過程中，對照組干酪中的菌落數略低于實驗組干酪，可能是由于菌株GSBa-1凝乳酶具有較強的蛋白水解作用，其水解產物有利于乳球菌繁殖。但是在成熟結束時對照組和實驗組干酪中乳酸菌的數量接近，均達到8.50～9.48（lg（CFU/g））。

2.2.3 干酪成熟過程中pH 4.6可溶性蛋白的變化

pH 4.6條件下可溶性蛋白中主要含有干酪成熟過程中產生的小分子肽和中等分子肽，蛋白含量的高低表明殘存的凝乳酶對乳蛋白質水解程度的高低，可作為干酪成熟程度的標志之一。Diezhandino等[21]研究表明pH 4.6可溶性氮主要是由于殘存的凝乳酶作用而產生，因在干酪制作過程中，添加的凝乳酶大部分會隨乳清而排掉，在干酪中殘留量大約占2%～6%。殘留的凝乳酶會持續對干酪中乳蛋白質產生水解作用，實驗組干酪菌株GSBa-1凝乳酶的pH 4.6可溶性蛋白含量較多，表明菌株GSBa-1凝乳酶對干酪乳蛋白的分解能力較強，可能呈現較多的風味前體物質。

2.2.4 干酪的游離氨基酸成分分析

表4 干酪在成熟30 d時的游離氨基酸組成和含量Table 4 Free amino acid composition of cheeses after 30 d of ripening at 4 ℃

干酪成熟后，干酪中游離氨基酸的含量與殘留的凝乳酶活力有關，殘留的凝乳酶可水解干酪中的酪蛋白生成大分子肽，進一步作用生成小分子肽、游離氨基酸以及風味化合物，而風味物質的前體物質是氨基酸。因此氨基酸含量的多少可作為乳蛋白質深度水解的標志。從表4可以看出，在2 組干酪中共檢測到29 種氨基酸，但其含量差別很大，其中對照組干酪含有少量的天冬氨酸，而實驗組干酪沒有檢測到；實驗組干酪含有少量的瓜氨酸、蛋氨酸、α-氨基己二酸和胱氨酸，而在對照組干酪中未檢測到。對照組干酪含量相對較高的氨基酸分別為苯丙氨酸、亮氨酸、肌肽和精氨酸，而實驗組干酪中含量相對較高的氨基酸分別為磷酸絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、鳥氨酸和賴氨酸。總體來看，實驗組干酪游離氨基酸總量（76 mg/100 g）高于對照組干酪游離氨基酸總量（55.3 mg/100 g）。因為在干酪成熟過程中乳球菌菌體發生自溶后會釋放出肽酶，可能是實驗組干酪中乳球菌自溶產生的肽酶活力較高所致。游離氨基酸是風味物質的主要前體，這有助于干酪形成獨特的風味，對干酪的滋味和香味都有促進作用[22]。

2.2.5 干酪成熟過程中質構的變化

在干酪成熟后，其質構特性如硬度、內聚性、彈性、咀嚼性和膠黏性等均有所變化。研究報道αS1-酪蛋白的分解是導致干酪的組織狀態和質構產生差異的重要原因[23]。此外，在干酪成熟中后期過程中，隨著pH值的升高，鈣離子較易從凝膠網狀結構中溶解出來，導致膠束的網狀結構被破壞，使得干酪結構變得松散[24]。由表5可知，實驗組干酪的硬度、內聚性、彈性、咀嚼性和膠黏性均大于對照組，其中咀嚼性和膠黏性差異較明顯，其他差異不明顯，說明實驗組添加菌株GSBa-1凝乳酶的干酪質構品質優于對照組。

表5 干酪成熟后硬度、內聚性、彈性、咀嚼性和膠黏性的質構分析Table 5 Hardness, cohesiveness, springiness, chewiness and adhesiveness of Mozzarella cheeses after ripening at 4 ℃

2.2.6 干酪成熟前后微觀結構的變化

在干酪成熟過程中，發酵劑中乳球菌發生自溶現象從而形成胞內和胞外酶，在這些酶以及殘存的凝乳酶作用下，乳蛋白不斷降解形成不同大小的孔洞，干酪中蛋白質和水分重新分布，從而對干酪微觀結構造成影響[25]。由圖3可知，菌株GSBa-1凝乳酶對干酪微觀結構的形成作用很大。研究表明，2 組干酪成熟前期由于酪蛋白彼此結合聚集，凝膠結構形成大小不均一的空穴，在干酪成熟后，酪蛋白形成的凝膠網狀結構發生變化，導致干酪的微觀結構發生明顯改變。對照組和實驗組干酪從成熟前到成熟后，干酪的網狀結構逐漸減弱，較大的孔洞逐漸消失，凝膠結構變得連續而緊密。有研究報道，孔周圍的干酪組織結構主要是由鈣磷酸鹽和副酪蛋白組織、含有重疊和交錯連接部分溶融的副酪蛋白聚合體構成[24]。這是由于在干酪中添加不同凝乳酶作用導致的，菌株GSBa-1凝乳酶和商品凝乳酶來源不同，其酶學性質和凝乳特性也不相同，導致其制作的干酪在成熟前后的微觀結構也會有所差異。

圖3 干酪成熟過程中微觀結構的變化Fig. 3 Microstructure change of cheeses during the ripening period

2.3 干酪成熟后風味物質的測定結果

表6 干酪成熟過程中揮發性風味物質的變化Table 6 Change in volatile compounds during ripening of cheeses

由表6可以看出，2 組干酪樣品在成熟后共檢測出21 種化合物，其中烷烴類物質5 種、脂肪酸類4 種、酮類2 種、醛類3 種、醇類4 種、酯類物質2 種、其他含苯環化合物1 種。實驗組干酪風味物質的種類多于對照組干酪，其中含量較高的是脂肪酸類、醇類和烷烴類化合物。這是由于添加不同凝乳酶的水解作用不同，菌株GSBa-1凝乳酶蛋白水解活力稍強，產生更多的風味物質。在發酵劑微生物和蛋白酶的共同作用下，干酪中的乳蛋白、乳脂肪和碳水化合物發生一系列錯綜復雜的生化反應，形成干酪獨特的風味物質。

從表6可知，2 組干酪在成熟后都有較多的烴類化合物，它們主要來源于原料乳本身[26]，而不是在干酪成熟過程中產生的，烴類化合物在所有干酪中都普遍存在，且種類較多，但由于烴類化合物的芳香閾值較高，因此這些化合物對風味的貢獻較小。酮類化合物一般由多不飽和脂肪酸的氧化或熱降解產生，也可由氨基酸降解或微生物代謝產生，其對于干酪的風味影響較大。2 組干酪中都有的酮類物質如3-羥基-2-丁酮，賦予干酪奶油的香味[27]，一般是由檸檬酸代謝過程中產生的二乙酸轉化而來。一般醛類物質的閾值較低，是食品氧化風味的主要來源。2 組干酪中都含有壬醛和癸醛，其中壬醛在干酪中較普遍存在，其能賦予干酪青草味和新鮮味。實驗組干酪還檢測到辛醛，而對照組干酪中未檢測到，可能菌株凝乳酶蛋白水解活力稍強，生成某種中間產物，進而轉化成辛醛，使得實驗組干酪風味更獨特。乙酸在實驗組干酪中有檢測到，其對干酪的風味影響較大，賦予干酪醋味，它是由乳酸或檸檬酸在發酵劑菌株的作用下生成的。丁酸在2 組干酪中均有檢測到，賦予干酪奶油氣味；實驗組干酪中酸類物質含量較多，此外還檢測到表現出體臭味的辛酸。醇類化合物一般具有水果芳香或植物香的香氣，但一般醇類化合物的閾值較高，對干酪風味的貢獻較小。但醇類化合物可與脂肪酸進一步反應形成酯類物質，因此可間接對干酪風味產生影響。實驗組干酪中檢測到的醇類物質明顯多于對照組，可見菌株凝乳酶對干酪的風味影響較大。酯類是在干酪中很重要的呈香類物質，可賦予干酪獨特的花草香味、水果香味以及甜味，此外還可緩和因中鏈、短鏈脂肪酸濃度較大引起的刺激性味道，從而使得干酪風味更加柔和[28]。2 組干酪在成熟后檢測到的酯類物質為乙酸乙酯，對照組干酪檢測到丁內酯，而實驗組干酪中未檢測到。乙酯類化合物是由乙醇和脂肪酸反應生成，因此干酪中的水果味可認為是由乙醇或它的前體物過量產生的。2 組干酪中含苯環的化合物種類較少，對照組干酪有0 種，實驗組有1 種。

2.4 干酪成熟后性能測定結果

2.4.1 保形性實驗結果

由圖4可知，對照組干酪樣品的保形性為（50.67±1.76）%，實驗組干酪樣品的保形性為（51.56±1.02）%，參照表2用于后續的綜合評分。

圖4 干酪樣品保形性效果Fig. 4 Conformality of cheese samples

2.4.2 拉絲性實驗結果

圖5 干酪樣品拉絲性效果Fig. 5 Stringiness of cheese samples

由圖5可知，2 組干酪樣品從烘箱中取出時迅速進行拉絲性測試，準確量取拉絲后干酪絲的長度得出，對照組干酪拉絲后長度為（145.67±4.04）mm，實驗組干酪拉絲后長度為（146±5.29）mm；此外，對照組拉絲后拉絲數為2 根，實驗組拉絲后拉絲數為1 根。

2.5 感官評定結果

表7 干酪感官評定結果Table 7 Sensory evaluation of cheeses

由表7可知，實驗組干酪與對照組干酪相比，口感和風味較好，這也與前面風味物質的測定結果相一致。2 組干酪樣品實驗得到保形性、拉絲性、出油性和總評分相比較，對照組稍好，但差異不明顯。總體來看，解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶能在一定程度上可以代替小牛凝乳酶應用于馬蘇里拉干酪的生產。

3 結 論

對照組和實驗組干酪由于添加的凝乳酶不同，制作的干酪理化成分稍有差異。添加菌株凝乳酶制得的干酪得率為8.84%，水分質量分數為46.82%，鹽質量分數為1.52%，蛋白質量分數為28.29%，脂肪質量分數為30.61%，與對照組干酪差異不大。實驗組干酪的乳球菌菌落數略高于對照組干酪，可能是由于菌株GSBa-1凝乳酶的蛋白水解產物有利于乳球菌繁殖。對干酪成熟過程中pH 4.6可溶性氮的變化進行分析，實驗組干酪pH 4.6可溶性蛋白含量較多，表明菌株GSBa-1凝乳酶對乳蛋白的分解能力較強，呈現較多的風味前體物質，實驗組干酪的游離氨基酸總量（76 mg/100 g）高于對照組干酪（55.3 mg/100 g）。

通過對成熟后2 組干酪質構的測定，實驗組干酪的質構特性均大于對照組，其中咀嚼性和膠黏性差異較明顯。此外，實驗組干酪所使用的菌株GSBa-1凝乳酶具有的蛋白水解能力稍強，導致實驗組干酪風味物質的種類多于對照組干酪，其中含量較高的是脂肪酸類、醇類和烷烴類的化合物，使得實驗組干酪的風味物質更加豐富。通過對干酪樣品的保形性和拉絲性實驗測定，結果表明，2 組干酪性能差異不大；進一步對2 種干酪進行感官評定，其總評分接近，表明2 種凝乳酶在用于馬蘇里拉干酪的制作中差異不明顯。綜上，解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶在一定程度上可代替小牛凝乳酶應用于馬蘇里拉干酪的生產。