蜂房哈夫尼亞菌對粘質(zhì)沙雷氏菌群體感應(yīng)信號分子產(chǎn)生與生物被膜形成的調(diào)控

李婷婷，高娜娜，于海鳳，國競文，王當(dāng)豐，勵(lì)建榮,*，黃建聯(lián)

（1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600；2.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；3.福建安井食品股份有限公司，福建 廈門 361022）

群體感應(yīng)是一種微生物細(xì)胞與細(xì)胞間的通訊方式，細(xì)菌通過自身產(chǎn)生的一些信號分子感知環(huán)境中與其共存細(xì)菌產(chǎn)生的信號分子，當(dāng)信號分子質(zhì)量達(dá)到一定濃度時(shí)啟動(dòng)細(xì)菌中相關(guān)靶標(biāo)基因的表達(dá)，調(diào)控微生物的特定功能，如運(yùn)動(dòng)性介導(dǎo)的銅綠假單胞菌與根癌土壤桿菌在生物膜共培養(yǎng)中的相互作用、熒光假單胞菌胞外酶的分泌及霍亂弧菌毒力因子的表達(dá)等[1-3]。革蘭氏陰性菌一般由LuxR/LuxI型系統(tǒng)調(diào)控，以N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯（N-acyl homoscrinc lactones，AHLs）為信號分子；革蘭氏陽性菌的信號分子一般為寡肽類化合物（autoinducing peptides，AIPs）；AI-2是細(xì)菌種間交流的信號分子，其結(jié)構(gòu)是一種呋喃硼酸二酯類物質(zhì)[4-6]。此外，細(xì)菌還存在其他群體感應(yīng)系統(tǒng)[7]。

蜂房哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）命名為H. alvei-14，屬于腸桿菌科哈夫尼亞屬，革蘭氏陰性菌，主要存在于污水、乳制品、土壤、人和動(dòng)物糞便中，是一種細(xì)菌性污染菌[8]和條件致病菌[9]。粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）命名為S. marcescens-01，屬于沙雷氏菌屬，革蘭氏陰性菌，是腸桿菌科的一種條件致病菌，存在于水、土壤、動(dòng)植物及人類的腸道和呼吸道中，能夠產(chǎn)生核酸酶、蛋白酶、脂肪酶等次級代謝產(chǎn)物，對人類存在潛在傷害[10]。

導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的實(shí)際環(huán)境為多菌種混雜共存并相互影響，單菌落存在的可能性非常小[11-12]。但目前多集中在單菌種的研究上，對基于群體感應(yīng)的2 株菌共培養(yǎng)體系的研究缺乏有效的方法和理論指導(dǎo)，對菌與菌之間生態(tài)關(guān)系及群體感應(yīng)方面的共生機(jī)理仍不清楚。而微生物生長特性的表達(dá)受生長階段、營養(yǎng)狀態(tài)等環(huán)境因素的影響，環(huán)境條件的改變會調(diào)控細(xì)菌群體感應(yīng)活性，進(jìn)而影響AHLs的分泌和生物被膜的形成。本實(shí)驗(yàn)擬從腐敗鱸魚中分離到的2 株具有群體感應(yīng)現(xiàn)象的H. alvei-14和S. marcescens-01為研究對象，探討在不同NaCl濃度、碳源、氮源、起始pH值條件下，與蜂房哈夫尼亞菌共培養(yǎng)的粘質(zhì)沙雷氏菌AHLs產(chǎn)生和生物被膜形成能力，旨在研究菌株在共培養(yǎng)條件下AHLs的分泌規(guī)律和生物被膜的形成能力，為水產(chǎn)品的保鮮和腐敗菌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

鮮活海鱸魚購于錦州市林西水產(chǎn)市場，平均質(zhì)量（1.5±0.5）kg。

供試菌株：從腐敗鱸魚中分離所得，經(jīng)16S rRNA序列比對鑒定為H. alvei-14和S. marcescens-01；報(bào)告菌株：紫色桿菌CV026（Chromobacterium violaceum CV026）、根癌農(nóng)桿菌A136（Agrobacterium tumefaciens A136），均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。菌株均在LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，CV026活化時(shí)需添加20 μg/mL卡那霉素，A136需涂布20 mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，X-gal）。

1.1.2 試劑

信號分子標(biāo)準(zhǔn)品（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL） 美國Sigma公司；卡那霉素國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀 德國Eppendorf公司；Quantity One凝膠成像系統(tǒng)、imark酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；HZQ-X300C型恒溫振蕩器、BPS-100CA恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；MS105UD電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司；Purifier Logic生物安全柜 美國Labconco公司；MLS-3020高壓蒸汽滅菌機(jī) 日本三洋公司；Biofuge Stratos冷凍高速離心機(jī)美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落分離和純化

購買鮮活鱸魚碎冰猝死，用無菌蒸煮袋包裝，置于4 ℃冰箱冷藏至腐敗，于無菌條件下稱取10 g腐敗魚肉剪碎，加90 mL無菌生理鹽水搖勻制成菌懸液，進(jìn)行梯度稀釋，選擇合適的稀釋度吸取1 mL于無菌平皿中，及時(shí)將15～20 mL平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻，待瓊脂凝固后置于37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。挑選各典型菌落，反復(fù)連續(xù)劃線，得到單菌落。初篩具有群體感應(yīng)現(xiàn)象的菌株。

1.3.2 細(xì)菌16S rRNA序列測定

取初篩菌株過夜活化，取1 m L新鮮菌液離心（10 000 r/min、10 min），留菌體。按照細(xì)菌基因組D N A快速抽提試劑盒方法提取基因組D N A作為1 6 S r R N A序列擴(kuò)增反應(yīng)模板，2 7 F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492 R（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序：94 ℃、4 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、95 s，共30 個(gè)循環(huán)后，72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.1%瓊脂糖凝膠電泳，然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。

1.3.3 AHLs活性檢測

1.3.3.1 初步檢測AHLs

平行劃線法[13]：報(bào)告菌株CV026和A136與供試菌株活化后，在LB營養(yǎng)瓊脂平板上平行劃線，以報(bào)告菌株做陰性對照，C6-HSL作陽性對照。28 ℃過夜培養(yǎng)，觀察顏色變化。

平板擴(kuò)散法[14]：報(bào)告菌株CV026和A136過夜活化，與LB營養(yǎng)瓊脂混勻并倒入已放好牛津杯的平板中，待其凝固后，加入150 μL/孔的AHLs粗提物，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察顏色變化。

1.3.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)定性檢測AHLs

分別將6 種AHLs標(biāo)準(zhǔn)品（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL和C14-HSL）溶于甲醇中配制為質(zhì)量濃度200 μg/mL的混合溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆茫糜贕C-MS檢測。

制備AHLs粗提物：參考綦國紅等[15]方法，將供試菌株在LB液體培養(yǎng)基中28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，離心（10 000 r/min、10 min）取上清液，用含0.01%冰乙酸的乙酸乙酯溶液等體積混合萃取3 次，混合有機(jī)相旋蒸至干，甲醇溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)AHLs能力檢測

將H. alvei-14和S. marcescens-01活化后，分別接種到10 mL LB培養(yǎng)基中，并在28 ℃振蕩（160 r/min）培養(yǎng)到光密度（OD595nm）為0.5左右。然后按S. marcescens-01和H. alvei-14體積比1∶1和1∶3混勻后以1%的總接種量接種在不同液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，取200 μL培養(yǎng)菌液測定AHLs誘導(dǎo)的變色圈直徑（mm），每組3 個(gè)平行。

不同液體培養(yǎng)基分別為：不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%）的液體培養(yǎng)基，不同pH值（5、6、7、8、9）的LB液體培養(yǎng)基，不同碳源（乳糖、蔗糖添加量為5.0 g/L，葡萄糖、果糖、木糖、麥芽糖添加量為5.26 g/L）的AB培養(yǎng)基（3.0 g/L K2HPO4，1.0 g/L NaH2PO4，1.0 g/L NH4Cl，0.3 g/L MgSO4·7H2O，0.15 g/L KCl、0.01 g/L CaCl2，0.002 5 g/L FeSO4·7H2O，酪蛋白水解氨基酸5.0 g/L），不同氮源（氯化銨、胰蛋白胨、酵母浸粉、尿素）的液體培養(yǎng)基。

1.3.5 S. marcescens-01生物被膜的形態(tài)觀察

將菌懸液稀釋100 倍添加在滅菌后的培養(yǎng)皿中，然后分別放入打磨后的鋅片，28 ℃靜置培養(yǎng)適宜的時(shí)間后取出鋅片，用無菌蒸餾水沖洗數(shù)遍，置于4 ℃預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液中浸泡4 h，進(jìn)而梯度乙醇脫水，再經(jīng)醋酸異戊酯置換2 次，15 min/次，取出后放入紫外滅菌后的超凈臺內(nèi)自然風(fēng)干。樣品噴金后，經(jīng)過掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.6 不同培養(yǎng)條件下生物被膜的培養(yǎng)及測定

將H. alvei-14和S. marcescens-01活化后，分別接種到10 mL LB培養(yǎng)基中，并在28 ℃振蕩（160 r/min）培養(yǎng)到光密度（OD595nm）為0.5左右。H. alvei-14和S. marcescens-01用不同液體培養(yǎng)基（同1.3.4節(jié)方法）稀釋100 倍后，按S. marcescens-01與H. alvei-14體積比1∶1和1∶3混勻后在96 孔板中28 ℃培養(yǎng)，每組3 個(gè)平行，以液體培養(yǎng)基為對照。培養(yǎng)48 h后采用結(jié)晶紫染色的方法在595 nm波長處測定光密度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

圖1 菌株H. alvei- 14和S. marcescens-01的16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 Electrophorograms of 16S rRNA PCR ampli fi cation products from H. alvei-14 and S. marcescens-01

圖2 基于16S rRNA基因序列H. alvei- 14和S. marcescens-01的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenic tree based on 16S rRNA sequence analysis of H. alvei-14 and S. marcescens-01

首先以菌株H. alvei-14和S. marcescens-01的總基因組DNA為模板，以細(xì)菌的通用引物擴(kuò)增16S rRNA序列，經(jīng)PCR特異性擴(kuò)增，對所獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序（圖1）。所測得的菌株H. alvei-14和S. marcescens-01的16S rRNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)與蜂房哈夫尼亞菌和粘質(zhì)沙雷氏菌的相似度高達(dá)99%。利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

2.2 AHLs檢測結(jié)果

表1 平行劃線法和瓊脂擴(kuò)散法對AHLs的檢測Table 1 Identification of AHLs production by parallel streak and agar diffusion methods

由表1可知，供試菌株都能誘導(dǎo)CV026變紫色，誘導(dǎo)A136水解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色。H. alvei-14分泌AHLs的能力較S. marcescens-01強(qiáng)。

2 種菌株對不同酰基側(cè)鏈長度及不同取代基AHLs敏感性不同，平行劃線和瓊脂擴(kuò)散法檢測與樣品中信號分子提取量和濃度有關(guān)，僅用于AHLs初步分析，不能確定AHLs種類和定量分析，而GC-MS可用于多種AHLs的定性和定量檢測，有靈敏性與準(zhǔn)確性更高的優(yōu)點(diǎn)[16]。

AHLs標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間和順序如圖3A所示，各峰分離良好，峰形尖銳且對稱，完全分離開來。從左到右依次為C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL和C14-HSL，保留時(shí)間分別為3.974、5.674、7.629、9.846、12.410、15.398 min。采用選擇離子監(jiān)測模式對未知樣品進(jìn)行檢測。通過菌株H. alvei-14粗提液（圖3B）、菌株S. marcescens-01粗提液（圖3C）的色譜圖與AHLs標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)菌株H. alvei-14粗提液和菌株S. marcescens-01粗提液可分別檢測到C6-HSL和C4-HSL、C6-HSL。

圖3 選擇離子監(jiān)測模式下標(biāo)準(zhǔn)品（A）、菌株H. alvei-14粗提液（B）、菌株S. marcescens-01粗提液（C）GC-MS圖Fig. 3 GC-MS chromatogram in selected ion monitoring (SIM) mode

2.3 生長動(dòng)力學(xué)曲線

圖4 菌株H. alvei- 14和S. marcescens-01的生長動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 4 Growth curves of H. alvei-14 and S. marcescens-01

圖4 為細(xì)菌的H. alvei-14和S. marcescens-01的生長動(dòng)力學(xué)曲線，0～4 h菌株呈指數(shù)增長趨勢，12～24 h菌株不斷生長，菌落數(shù)緩慢上升，24 h后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌株生長較平穩(wěn)。菌株H. alvei-14生長能力較S. marcescens-01強(qiáng)，但是基本趨勢相同。后期實(shí)驗(yàn)，采用OD595nm為0.5左右的菌株，此時(shí)菌株處于對數(shù)期，仍具有較好生長能力，活性較穩(wěn)定，便于實(shí)驗(yàn)研究。

2.4 不同培養(yǎng)條件下AHLs的分泌

圖5 不同培養(yǎng)條件下AHLs的分泌Fig. 5 Effects of different culture conditions on secretion of AHLs

如圖5A所示，與陰性對照（NaCl為0%）相比，一定NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%～2%）可刺激菌株分泌AHLs，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%時(shí)，菌株生長受到抑制，AHLs產(chǎn)量明顯減少。與對照S. marcescens-01相比，共培養(yǎng)體系在各質(zhì)量分?jǐn)?shù)下變色圈直徑均變大，說明共培養(yǎng)后促進(jìn)AHLs的分泌。Ravn等[17]研究表明，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，變形斑沙雷氏菌B5a的信號分子分泌量減少，而成團(tuán)腸桿菌B6a的信號分子分泌量會增加，說明NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)會對菌株分泌信號分子產(chǎn)生不同程度的影響。

如圖5B所示，以LB為對照，S. marcescens-01誘導(dǎo)CV026紫色圈直徑僅達(dá)到20.35 mm；且僅以木糖、果糖為碳源時(shí)才能檢測到AHLs。共培養(yǎng)體系以葡萄糖、果糖、木糖、麥芽糖為碳源時(shí)，產(chǎn)AHLs的能力較強(qiáng)；而對乳糖、蔗糖利用程度較低，產(chǎn)AHLs的能力較弱。Geisenberger等[18]對于銅綠假單胞菌的研究表明，在補(bǔ)充添加0.2%葡萄糖作為唯一碳源時(shí)分泌的AHLs種類和含量最高。說明碳源不同，導(dǎo)致菌株分泌信號分子的能力不同。

如圖5C所示，S. marcescens-01僅以蛋白胨為氮源時(shí)才能檢測到AHLs，變色圈直徑為19.01 mm。共培養(yǎng)體系以尿素為氮源，菌液密度較大，但分泌信號分子的能力較差；以蛋白胨和氯化銨為氮源，菌體密度較小，但分泌AHLs的量較多。Dandekar等[19]研究比較了380 個(gè)可溶氮源中的銅綠假單胞菌AHL合成突變體加或減對AHL的生長，發(fā)現(xiàn)在以Glu-Tyr、His-Trp、Tyr-Gly-Gly、Tyr-Phe、Tyr-Trp和Tyr-Tyr作為氮源的信號存在下，生長得到改善。說明在特定氮源存在下，可改善菌株生長，進(jìn)而調(diào)控AHLs的分泌。

如圖5D所示，共培養(yǎng)體系在不同pH值下產(chǎn)AHLs能力的趨勢與S. marcescens-01相似，在pH 7時(shí)分泌信號分子的能力最強(qiáng)，變色圈直徑達(dá)到最大，pH過低或過高時(shí)，菌株生長未受到明顯影響，但AHLs分泌能力下降。

2.5 不同時(shí)間S. marcescens-01生物被膜掃描電子顯微鏡觀察

圖6 不同培養(yǎng)時(shí)間下S. marcescens-01生物被膜形態(tài)（×10 000）Fig. 6 Bio fi lm morphology of S. marcescens-01 at different culture times ( × 10 000)

生物被膜是指菌體黏附于載體表面，分泌黏性的胞外多聚物，并與其他成分組成胞外基質(zhì)將其自身包圍其中而形成復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)，能使細(xì)菌高度耐藥，抵抗不利環(huán)境[20]。細(xì)菌生物被膜的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程。細(xì)菌的生物被膜一般會經(jīng)歷：1）初始附著期；2）不可逆附著期；3）初始形成和發(fā)展期；4）成熟期；5）脫落期。如圖6所示，在12 h菌體開始聚集黏附在鋅片表面；隨著時(shí)間的延長，鋅片表面附著的菌體數(shù)目逐漸增多，細(xì)菌之間開始黏結(jié)，且胞外聚合物將菌體包裹其中，進(jìn)而生成成團(tuán)聚集的生物被膜，36～60 h是生物被膜形成的發(fā)展成熟和穩(wěn)定階段。

2.6 不同培養(yǎng)條件下生物被膜的形成

圖7 不同培養(yǎng)條件對生物被膜的影響Fig. 7 Effect of different culture conditions on the formation of biofilm

如圖7A所示，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)菌細(xì)胞因滲透壓過高而脫水，導(dǎo)致其失水死亡，進(jìn)而抑制生物被膜的形成。H. alvei-14與S. marcescens-01共培養(yǎng)，生物被膜形成能力增強(qiáng)，S. marcescens-01與H. alvei1∶3產(chǎn)生物被膜的能力強(qiáng)于共培養(yǎng)體系S. marcescens-01與H. alvei1∶1體系。

如圖7B所示，以LB培養(yǎng)基為對照，添加碳源促進(jìn)了菌株S. marcescens-01生物被膜的形成。共培養(yǎng)體系以木糖、乳糖為碳源，生物被膜生成量最多，以麥芽糖為碳源時(shí)，生物被膜生長較差。劉晶晶等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在25 ℃條件下，麥芽糖和乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0.2%增至1.4%時(shí)，金黃色葡萄糖球菌-大腸桿菌混合生物被膜形成較快。

如圖7C所示，S. marcescens-01與共培養(yǎng)體系均以酵母浸粉為氮源時(shí)，生物被膜產(chǎn)生量最多，而以氯化銨為氮源時(shí)，生物被膜量形成較少。不同氮源會使菌的生長速率出現(xiàn)差異，并進(jìn)一步對生物膜的黏附和代謝活性等產(chǎn)生影響[22]。

由圖7D所示，生物被膜生長的最佳pH值都為7，生長環(huán)境中pH值過低或過高均不利于微生物生物被膜的形成。

3 討 論

共存體系中微生物互相作用是一個(gè)復(fù)雜的過程，不僅存在菌落間競爭營養(yǎng)物質(zhì)，還存在代謝產(chǎn)物對彼此菌體的影響[23]。與對照S. marcescens-01相比，2 個(gè)共培養(yǎng)體系在各不同培養(yǎng)條件下變色圈直徑變大，說明共培養(yǎng)后促進(jìn)AHLs的分泌，其原因可能在于H. alvei-14的存在被S. marcescens-01認(rèn)為是一種環(huán)境刺激，其通過某些調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié)自身AHLs的合成，這種調(diào)控機(jī)制可能包括對H. alvei-14的感知和對AHLs合成的調(diào)控。環(huán)境條件的改變會影響AHL的產(chǎn)生量，即在環(huán)境中可能存在影響AHL積累的因素，或者是存在一些因素抑制與AHL合成相關(guān)基因的表達(dá)。鈉離子不參與細(xì)胞的組成，但仍是微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的必需成分，鈉離子與維持細(xì)胞滲透壓有關(guān)，在培養(yǎng)基中常常加入少量鈉鹽，但是用量不能過高，否則會影響微生物的生長，氯離子在一般微生物中不具有營養(yǎng)作用，但是對某些微生物生長是必需的[24]。低NaCl含量和高NaCl含量均會抑制AHLs的分泌[25]。糖類在微生物正常生長有著重要作用，一般來說微生物對單糖的利用程度優(yōu)于雙糖和多糖[26]，可能由于木糖、葡萄糖、果糖均為單糖，共培養(yǎng)體系對其利用程度較高，產(chǎn)AHLs的能力較強(qiáng)；而蔗糖、麥芽糖、乳糖均為雙糖，菌株對麥芽糖、蔗糖利用能力依次降低，AHLs活性隨著降低；而以乳糖為碳源時(shí)，菌株密度較小，但產(chǎn)AHLs的能力則相反，其原因可能為乳糖為菌株的限制性碳源，不利環(huán)境反而促進(jìn)了AHLs的產(chǎn)生；因此在水產(chǎn)品加工過程中，應(yīng)盡量選用蔗糖、乳糖等為原料，以減少由AHLs介導(dǎo)的食品腐敗的發(fā)生。通常，微生物生長所需的氮源主要分為有機(jī)氮源和無機(jī)氮源兩大類，其中有機(jī)氮源物質(zhì)成分復(fù)雜，主要是蛋白質(zhì)及其降解物，而微生物對無機(jī)氮源的吸收利用能力較強(qiáng)。菌株對蛋白胨的吸收利用能力較差，而在脅迫環(huán)境下，菌株刺激自身分泌大量的AHLs，而氯化銨可能是為其限制性氮源不利于菌株生長，但可以刺激菌體群體感應(yīng)系統(tǒng)，促進(jìn)AHLs的釋放。相比堿性，菌株在酸性環(huán)境下產(chǎn)AHLs能力較強(qiáng)可能是因?yàn)椴焕h(huán)境下共培養(yǎng)體系感知危機(jī)信號，啟動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)，刺激群體感應(yīng)應(yīng)急機(jī)制而分泌大量的AHLs，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的[27]。

在自然條件下，大多數(shù)生物被膜是由許多微生物組成的混合生物被膜，被膜態(tài)細(xì)菌具有浮游菌不具有的優(yōu)勢，這增加了不同微生物之間的相互作用和胞外分泌物的復(fù)雜性，從而改變生物被膜的生理特性及功能。生物被膜的形成與胞外聚合物的分泌有關(guān)，而胞外聚合物的分泌離不開營養(yǎng)物質(zhì)，所以營養(yǎng)物質(zhì)對細(xì)菌生物被膜的形成至關(guān)重要[28]。Brink等[29]研究報(bào)道，影響益生菌生物被膜形成除去自身基因調(diào)控的因素外，還存在其他環(huán)境因素如培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的不足及限制性碳源的供給均有利于生物被膜的形成。高質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl溶液能使細(xì)菌細(xì)胞因滲透壓過高而脫水，抑制其生長繁殖，進(jìn)而抑制生物被膜的形成。可能由于麥芽糖為雙糖，菌株對其利用程度較低，生物被膜生長較差。以氯化銨為氮源時(shí)，菌株菌液密度較低，生物被膜生長較差。pH值一般對處于生物膜形成初期的浮游菌和周圍的活菌產(chǎn)生影響，通常中性環(huán)境對生物被膜的形成有利[30]。在酸性條件下，微生物胞外分泌物可能會發(fā)生變性，而不利于其生物被膜的形成；在堿性條件下，不利于菌體的聚集，進(jìn)而抑制其生物被膜的形成。因此，生長環(huán)境中pH值過低或過高均不利于微生物生物被膜的形成。

4 結(jié) 論

與蜂房哈夫尼亞菌共培養(yǎng)能促進(jìn)粘質(zhì)沙雷氏菌分泌AHLs和形成生物被膜，這種影響可能與菌群間群體感應(yīng)有關(guān)。環(huán)境條件的改變是影響細(xì)菌分泌AHLs和生物被膜形成的重要影響因子，較高鹽含量、pH值過低或過高均不利于微生物分泌AHLs和生物被膜的形成，而限制性碳源及氮源等脅迫環(huán)境均可以刺激菌體群體感應(yīng)系統(tǒng)，促進(jìn)AHLs的釋放和生物被膜的形成。因此在水產(chǎn)品加工過程中應(yīng)選擇更適合的食品加工和貯藏條件，以減少由AHLs介導(dǎo)的食品腐敗的發(fā)生和生物被膜的形成。