嗜熱鏈球菌KLDS3.1012胞外多糖合成途徑的基因組學及表型特征分析

李柏良，趙 莉，王成鳳，靳 妲，丁秀云,2，劉 飛,*，霍貴成

（1.東北農(nóng)業(yè)大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.廣州基迪奧生物科技有限公司，廣東 廣州 510000）

嗜熱鏈球菌是非致病性乳酸菌，常與德氏乳桿菌保加利亞亞種組合使用，作為酸奶的發(fā)酵劑[1-2]。部分嗜熱鏈球菌可以產(chǎn)生胞外多糖（exopolysaccharides，EPS），EPS分泌到培養(yǎng)基中，其不僅可以改善發(fā)酵乳制品的流變學和感官特性[3-4]，還具有諸多的益生特性，如抗氧化性和抗腫瘤活性、降低血壓和血糖、改善腸道菌群、抑制致病菌和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等[5-9]。因此，能夠產(chǎn)EPS的嗜熱鏈球菌菌株在發(fā)酵方面具有更大的價值。

EPS的合成過程分為前體物質(zhì)糖核苷酸的合成及EPS基因簇合成EPS兩個階段。單糖、雙糖作為微生物主要利用的碳源，經(jīng)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，糖類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運方式一般有3 種：磷酸烯醇式丙酮酸依賴磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS）、ABC型糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)以及糖滲透[10]。其中PTS為主要的轉(zhuǎn)運方式，由負責糖類物質(zhì)磷酸化的可溶性磷酸載體蛋白HPr、能量耦合蛋白酶EI以及膜結(jié)合的具有糖特異性的通透酶EII組成。通常EII由3 個功能性的亞單位EIIA、EIIB與EIIC構(gòu)成，轉(zhuǎn)運甘露糖的PTS則由EIIA、EIIB、EIIC與EIID組成。根據(jù)序列及結(jié)構(gòu)的特征，EII可以分為乳糖家族、葡萄糖家族、甘露糖家族及甘露醇家族。在糖轉(zhuǎn)運過程中，如果某一PTS中的EII因缺失亞基而不完整，是不可以通過另一個非同家族的PTS的EII替代其功能。轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)的糖經(jīng)過一系列的酶促反應，最后形成糖核苷酸，作為合成EPS的活性前體[11]。

參與指導EPS重復單元合成、鏈長、聚合與輸出的基因常成簇存在，稱之為EPS基因簇。異型多糖重復單元的形成通過引導糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移相應的糖核苷酸到異戊二烯醇磷酸酯（脂載體）上，在其他的糖基轉(zhuǎn)移酶作用下，高度特異性地轉(zhuǎn)移相應的糖核苷酸形成重復單元的主、側(cè)鏈。已經(jīng)形成的重復單元經(jīng)翻轉(zhuǎn)酶從胞內(nèi)輸出至細胞外膜，隨后經(jīng)聚合酶聚合成完整的EPS，輸出至細胞膜外[12-13]。

嗜熱鏈球菌KLDS3.1012是從中國新疆傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中分離出來的，由東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室保藏。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)該菌株具產(chǎn)黏性能強及所產(chǎn)酸奶品質(zhì)優(yōu)良等特點，適合于制備高品質(zhì)直投式發(fā)酵劑[14]。為更加深入分析該菌株合成ESP的遺傳基礎，本研究首先通過二代測序技術對該菌株進行基因組測序，基于生物信息學分析該菌株的糖代謝能力及EPS基因簇，同時利用API 50CH測定該菌株的糖發(fā)酵情況，并采用高效離子交換色譜法測定EPS的單糖組成。為研究該菌株EPS遺傳基礎與EPS結(jié)構(gòu)之間關系及后續(xù)更加合理地應用該菌株提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜熱鏈球菌KLDS3.1012由東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室工業(yè)微生物菌種保藏中心（KLDSDICC）提供，且通過16S rRNA基因測序鑒定。

M17肉湯培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術有限公司；細菌基因組提取試劑盒 北京天根生物技術有限公司；API 50CH 法國梅里埃公司；DEAE-Sepharose Fast Flow和Sepharose CL-6B填料 美國GE醫(yī)療生命科學公司；無水乙醇 天津市天力化學試劑有限公司；三氯乙酸、三氟乙酸 天津市大茂化學試劑廠；重蒸苯酚北京博奧拓達科技有限公司；濃硫酸 哈爾濱理工化學試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

LDZF-50KB-II立式蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；CJ-2D超凈工作臺 天津泰斯特儀器有限公司；DHP-927型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；透析袋 北京索萊寶生物科技有限公司；蛋白純化儀美國GE醫(yī)療生命科學公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化及基因組提取

將甘油保藏的菌株KLDS3.1012以2%的體積分數(shù)接種于M17液體培養(yǎng)基，42 ℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接兩次，第3次培養(yǎng)12 h后用于基因組提取。按照細菌基因組提取試劑盒說明書的步驟提取菌株KLDS3.1012的基因組。

1.3.2 全基因組測序及組裝

利用Illumina HiSeq（2×100 bp配對末端文庫）和Illumina MiSeq（2×250 bp配對末端文庫）平臺組合測序技術對菌株KLDS3.1012進行基因組測序。通過進行質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)過濾，利用SOAPdenovo 2.0對所有有效數(shù)據(jù)（Clean Data）進行組裝[15]。

1.3.3 基因組注釋

采用NCBI原核生物基因組注釋流程（prokaryotic genome annotation pipeline，PGAP，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK174280/）進行基因預測及注釋。基因組中蛋白序列通過WebMGA網(wǎng)站進行COG（Cluster of Orthologous Group）注釋[16]。

1.3.4 生物信息學分析

利用CGView Server構(gòu)建基因組圖譜[17]。糖代謝途徑參照KEGG通路數(shù)據(jù)庫進行分析[18]。ISfinder用于鑒定基因組序列中的轉(zhuǎn)座酶[19]。使用ACT（Artemis Comparison Tool）軟件對菌株KLDS3.1012與嗜熱鏈球菌ND03的EPS基因簇進行分析[20]。

1.3.5 表型特征的測定

采用API CHL培養(yǎng)基和API 50CH測試條按照試劑盒說明書測定菌株KLDS3.1012的碳水化合物利用情況。按照邵麗[21]所述的實驗步驟，提取菌株KLDS3.1012所產(chǎn)的EPS。參考Ren Wei等[22]的方法利用DEAESepharose Fast Flow和Sepharose CL-6B對EPS進行純化。參照邵麗[21]的方法，使用高效離子交換色譜（high performance anion exchange chromatography，HPAEC）法進行單糖組成的測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用HPAEC測定各標準品的保留時間和峰面積，以各濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。對樣品中各單糖的峰面積進行積分，根據(jù)標準曲線計算相應的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組的基本特征及注釋

圖1 嗜熱鏈球菌KLDS3.1012的基因組圈圖Fig. 1 Circular genome map of S. thermophilus KLDS3.1012

菌株KLDS3.1012的基因組序列已提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為：NZ_LHSK01000000。通過CGView Server構(gòu)建其基因組圈圖（圖1）并利用PGAP流程進行注釋，一共預測出1 992 個基因，其中包括1 705 個蛋白編碼基因，213 個假基因，15 個rRNA，55 個tRNA和4 個ncRNA。

菌株KLDS3.1012的親緣關系報告（表1）顯示，菌株KLDS3.1012與嗜熱鏈球菌ND03在基因組序列最為相似（99.572 2%），親緣關系最近，而與嗜熱鏈球菌M17PTZA496的基因組序列差異較大，對稱一致性僅為83.842 8%。

表1 嗜熱鏈球菌親緣關系報告Table 1 Genome neighbor report of S. thermophilus strains

2.2 糖代謝能力分析

2.2.1 糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)

菌株KLDS3.1012不僅含有HPr（AKL23_RS05975）和EI（AKL23_RS05970），還含有10 個糖特異性通透酶（EII）的基因，其中包括蔗糖通透酶EII的基因、PTS果糖通透酶EII、PTS甘露糖通透酶EII和PTS葡萄糖通透酶EII（表2）。然而，PTS葡萄糖通透酶EII是由假基因編碼的，而另外2 個EII基因也不完整，因此不能通過PTS轉(zhuǎn)運葡萄糖。在菌株KLDS3.1012的基因組中鑒定到乳糖/半乳糖滲透酶（AKL23_RS06545）和葡萄糖滲透酶（AKL23_RS04150）。由于編碼ABC型糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的基因不完整，因此ABC型糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)不能將糖轉(zhuǎn)運到菌株KLDS3.1012的細胞質(zhì)中。綜上所述，從基因組分析，菌株KLDS3.1012可以利用蔗糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和乳糖。

表2 嗜熱鏈球菌KLDS3.1012的PTS相關基因Table 2 Putative genes related to phosphotransferase system (PTS) in S. thermophilus KLDS3.1012

2.2.2 糖核苷酸的合成途徑

被轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中的糖會通過各種代謝途徑生成糖核苷酸。如圖2所示，菌株KLDS3.1012可以通過β-半乳糖苷酶（AKL23_RS06540）水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖，一方面，半乳糖通過UDP-半乳糖的途徑（AKL23_RS06565和AKL23_RS06560）轉(zhuǎn)化生成UDP-半乳糖和Leloir途徑轉(zhuǎn)化生成葡萄糖-1-磷酸。另一方面，葡萄糖被葡萄糖激酶（AKL23_RS03575）磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，再由磷酸變位酶（AKL23_RS03880）進一步形成葡萄糖-1-磷酸。葡萄-1-磷酸作為重要的中間產(chǎn)物，它可以通過UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（AKL23_RS08610）轉(zhuǎn)化成UDP-葡萄糖或通過一系列酶促反應（AKL23_RS05870、AKL23_RS05860、AKL23_RS05865、AKL23_RS03055和AKL23_RS06935）生成dTDP-鼠李糖。編碼UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶的基因具有3 個拷貝（AKL23_RS05370、AKL23_RS06390和AKL23_RS06555），這可能與UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖之間的相互轉(zhuǎn)換相關。甘露糖、果糖和蔗糖轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中后分別被磷酸化形成甘露糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸和蔗糖-6-磷酸，三者之間可以相互轉(zhuǎn)化（AKL23_RS08125、AKL23_RS08110和AKL23_RS10365）。隨后，果糖-6-磷酸由AKL23_RS04205、AKL23_RS05900和AKL23_RS02810編碼的一系列酶轉(zhuǎn)化成UDP-N-乙酰葡糖胺。總之，從基因組分析，菌株KLDS3.1012能夠形成4 種糖核苷酸，即UDP-葡萄糖、dTDP-鼠李糖、UDP-半乳糖和UDP-乙酰葡糖胺。這些糖核苷酸可以形成EPS的重復單元，再通過EPS基因簇形成EPS。

圖2 嗜熱鏈球菌KLDS3.1012糖核苷酸的合成Fig. 2 Synthesis of sugar nucleotides in S. thermophilus KLDS 3.1012

2.3 EPS基因簇的生物信息學分析

如圖3所示，菌株KLDS3.1012存在1 個EPS合成基因簇（圖4），由35 個基因組成。在該基因簇中的5'末端存在1 個嘌呤核苷磷酸化酶的編碼基因deoD（AKL23_RS05125），該基因存在于大部分EPS基因簇附近[23-24]。基因AKL23_RS05120、AKL23_RS05115、AKL23_RS05110和AKL23_RS05105分別負責編碼EPS的合成調(diào)節(jié)、鏈長決定和輸出相關的保守基因。AKL23_RS05100編碼的起始糖基轉(zhuǎn)移酶，可以將UDP-半乳糖轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)載體上。負責編碼其他糖基轉(zhuǎn)移酶的基因分別是AKL23_RS05095（假基因）、AKL23_RS05070、AKL23_RS05025（UDP-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶），AKL23_RS05020、AKL23_RS05015和AKL23_RS05000，這些糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因?qū)Q定EPS的單糖組成起到關鍵的作用。AKL23_RS05055編碼的翻轉(zhuǎn)酶具有將重復單位輸出的功能。AKL23_RS004985編碼的orf14.9與生長功能相關，該基因也存在于其他嗜熱鏈球菌的EPS基因簇中[25]。AKL23_RS004980和AKL23_RS004960分別編碼磷酸酶和通透酶。此外，該基因簇中還存在3 個磷酸甘油酸變位酶的編碼基因（AKL23_RS004975、AKL23_RS004970和AKL23_RS004965）。

圖3 嗜熱鏈球菌KLDS3.1012的EPS基因簇Fig. 3 Exopolysaccharides gene cluster in S. thermophilus KLDS3.1012

前面的基因組親緣關系研究表明，菌株KLDS3.1012與嗜熱鏈球菌ND03的基因組序列親緣關系最近，高達99.57%。通過ACT工具對2 株菌的EPS基因簇序列進行比對分析，由圖4可知，菌株KLDS3.1012 EPS基因簇與嗜熱鏈球菌ND03的EPS基因簇具有很高的同源性，僅存在7 個倒置區(qū)域，而且中間的空白區(qū)域是由于菌株KLDS3.1012的gap造成的。

圖4 嗜熱鏈球菌KLDS3.1012 EPS基因簇的比對分析Fig. 4 Alignment of exopolysaccharides gene cluster in S. thermophilus KLDS3.1012

2.4 碳水化合物代謝能力

API 50CH碳水化合物代謝結(jié)果（圖5）表明，菌株KLDS3.1012可以代謝半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖和蔗糖。雖然與其他嗜熱鏈球菌碳水化合物代謝能力存在差異，但是菌株KLDS3.1012在碳水化合物利用方面，遺傳分析與表型結(jié)果是相一致的。

圖5 嗜熱鏈球菌KLDS3.1012的API 50CH發(fā)酵結(jié)果Fig. 5 Results of API 50CH test strip on S. thermophilus KLDS3.1012

2.5 EPS的單糖組成

菌株KLDS3.1012所產(chǎn)的EPS通過DEAE-Sepharose Fast Flow和Sepharose CL-6B進行兩步純化，隨后經(jīng)三氟乙酸水解，最后用高效離子色譜測定EPS的單糖組成。由圖6可知，菌株KLDS3.1012所產(chǎn)的EPS由鼠李糖、半乳糖和葡萄糖以2.6∶1.7∶1的物質(zhì)的量比組成。在單糖組成中沒有發(fā)現(xiàn)UDP-N-乙酰葡糖胺，然而，生物信息學分析表明菌株KLDS3.1012可以形成UDP-N-乙酰葡糖胺并且擁有UDP-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶，這可能是由于相關基因表達水平的不足造成的，還需要進一步的研究驗證這一點。

圖6 嗜熱鏈球菌KLDS3.1012的EPS單糖離子色譜圖Fig. 6 HPAEC profile of monosaccharide composition of EPS from S. thermophilus KLDS3.1012

3 討 論

嗜熱鏈球菌作為重要的發(fā)酵劑，從功能上看，嗜熱鏈球菌在治療乳糖不耐癥、抗氧化、改善腸道免疫反應和緩解一些癌癥方面起著至關重要的作用[26]。從代謝能力上看，嗜熱鏈球菌不僅能夠代謝碳水化合物形成乳酸，酸化乳制品，還能形成糖核苷酸產(chǎn)生EPS[27-28]。嗜熱鏈球菌所產(chǎn)的EPS具有結(jié)構(gòu)復雜和功能多樣的特點，因此作為近年來的持續(xù)熱點問題。隨著基因組測序技術的發(fā)展，研究人員可以利用生物信息學的手段充分挖掘嗜熱鏈球菌所合成的EPS的相關分子元件，為揭示嗜熱鏈球菌合成EPS的機理及調(diào)控提供基礎。Bolotin等[29]研究了嗜熱鏈球菌CNRZ1066和LMG13811的糖代謝相關遺傳基礎；Sun Zhihong等[30]完成了ND03的全基因組測序并對其獨特的EPS基因簇進行分析；Wu Qinglong等[23]通過嗜熱鏈球菌ASCC 1275的EPS基因簇分析，發(fā)現(xiàn)該菌株高產(chǎn)EPS的相關基因；Bai Ying等[31]報道了嗜熱鏈球菌MN-BM-A01的EPS產(chǎn)量和相關基因的分析；Vendramin等[32]對8 株已完成基因組測序的嗜熱鏈球菌epsA基因的啟動子進行了比較基因組學分析。本研究不僅從生物信息學層面分析了菌株KLDS3.1012的糖代謝能力及EPS基因簇，同時還利用API 50CH測定該菌株的糖發(fā)酵情況及采用高效離子交換色譜法測定EPS的單糖組成，為研究EPS的基因與結(jié)構(gòu)奠定了基礎。

雖然嗜熱鏈球菌在糖代謝水平上相對保守，然而不同的嗜熱鏈球菌菌株的糖代謝情況并不一致，嗜熱鏈球菌基本都可以利用葡萄糖、乳糖和果糖[33]，而半乳糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、蜜二糖和棉子糖的利用卻有菌株特異性[34-35]，如嗜熱鏈球菌AR333可以利用葡萄糖、乳糖和蔗糖[22]，嗜熱鏈球菌MTCC 5461可以利用17 種碳水化合物[36]，而本研究中的菌株KLDS3.1012可以利用半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖和蔗糖。能夠利用半乳糖是工業(yè)發(fā)酵菌株的優(yōu)良性狀，可以避免半乳糖的過量積累而影響發(fā)酵乳制品的質(zhì)量。此外，利用半乳糖可以提高EPS的產(chǎn)量，因為半乳糖可以形成糖核苷酸。嗜熱鏈球菌所產(chǎn)EPS的單糖組成及比例也都不一樣，AR333和GST-6所產(chǎn)的EPS都由半乳糖和葡萄糖組成，但是物質(zhì)的量比差異較大[5,22]，DGCC 7785所產(chǎn)的EPS由半乳糖、葡萄糖和N-乙酰半乳糖胺組成[37]，而本研究中的KLDS3.1012所產(chǎn)的EPS由鼠李糖、半乳糖和葡萄糖，與嗜熱鏈球菌DGCC 7698所產(chǎn)的EPS具有相似性[37]。

糖核苷酸作為合成EPS的活性前體，是合成EPS的關鍵底物[11]。在分析菌株KLDS3.1012的糖核苷酸合成途徑中發(fā)現(xiàn)，在其基因組中，催化UDP-葡萄糖與UDP-半乳糖相互轉(zhuǎn)變的UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶的編碼基因高達3 個拷貝，利于二者的靈活轉(zhuǎn)變，以滿足形成重復單元過程中對不同糖核苷酸的需求。嗜熱鏈球菌的EPS基因簇中參與指導EPS重復單元合成、鏈長、聚合與輸出的基因相對保守，而糖基轉(zhuǎn)移酶差別甚大，其具有多態(tài)性，目前，在51 株嗜熱鏈球菌中存在118 個糖基轉(zhuǎn)移酶，不同的糖基轉(zhuǎn)移酶可以轉(zhuǎn)移不同的糖核苷酸形成EPS的重復單元[38]，因此糖基轉(zhuǎn)移酶對EPS的結(jié)構(gòu)起到?jīng)Q定性作用。本研究中菌株KLDS3.1012的糖基轉(zhuǎn)移酶中只鑒定出半乳糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶和UDP-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶，此外，該菌株的EPS基因簇與嗜熱鏈球菌ND03的EPS基因簇具有很高的同源性。

4 結(jié) 論

從基因組水平分析，菌株KLDS3.1012具有半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖和蔗糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和4 種糖核苷酸（UDP-葡萄糖、dTDP-鼠李糖、UDP-半乳糖和UDP-N-乙酰葡糖胺）合成的相關基因及1 個胞外多糖合成基因簇。表型測定結(jié)果表明菌株KLDS3.1012可以利用以上6 種碳源并能形成由鼠李糖、半乳糖和葡萄糖組成的EPS。