嗜熱鏈球菌KLDS3.1012胞外多糖合成途徑的基因組學及表型特征分析

李柏良，趙 莉，王成鳳，靳 妲，丁秀云,2，劉 飛,*，霍貴成

（1.東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.廣州基迪奧生物科技有限公司，廣東 廣州 510000）

嗜熱鏈球菌是非致病性乳酸菌，常與德氏乳桿菌保加利亞亞種組合使用，作為酸奶的發酵劑[1-2]。部分嗜熱鏈球菌可以產生胞外多糖（exopolysaccharides，EPS），EPS分泌到培養基中，其不僅可以改善發酵乳制品的流變學和感官特性[3-4]，還具有諸多的益生特性，如抗氧化性和抗腫瘤活性、降低血壓和血糖、改善腸道菌群、抑制致病菌和調節免疫系統等[5-9]。因此，能夠產EPS的嗜熱鏈球菌菌株在發酵方面具有更大的價值。

EPS的合成過程分為前體物質糖核苷酸的合成及EPS基因簇合成EPS兩個階段。單糖、雙糖作為微生物主要利用的碳源，經轉運系統轉運至胞內，糖類物質的轉運方式一般有3 種：磷酸烯醇式丙酮酸依賴磷酸轉移酶系統（phosphotransferase system，PTS）、ABC型糖轉運系統以及糖滲透[10]。其中PTS為主要的轉運方式，由負責糖類物質磷酸化的可溶性磷酸載體蛋白HPr、能量耦合蛋白酶EI以及膜結合的具有糖特異性的通透酶EII組成。通常EII由3 個功能性的亞單位EIIA、EIIB與EIIC構成，轉運甘露糖的PTS則由EIIA、EIIB、EIIC與EIID組成。根據序列及結構的特征，EII可以分為乳糖家族、葡萄糖家族、甘露糖家族及甘露醇家族。在糖轉運過程中，如果某一PTS中的EII因缺失亞基而不完整，是不可以通過另一個非同家族的PTS的EII替代其功能。轉運到細胞內的糖經過一系列的酶促反應，最后形成糖核苷酸，作為合成EPS的活性前體[11]。

參與指導EPS重復單元合成、鏈長、聚合與輸出的基因常成簇存在，稱之為EPS基因簇。異型多糖重復單元的形成通過引導糖基轉移酶轉移相應的糖核苷酸到異戊二烯醇磷酸酯（脂載體）上，在其他的糖基轉移酶作用下，高度特異性地轉移相應的糖核苷酸形成重復單元的主、側鏈。已經形成的重復單元經翻轉酶從胞內輸出至細胞外膜，隨后經聚合酶聚合成完整的EPS，輸出至細胞膜外[12-13]。

嗜熱鏈球菌KLDS3.1012是從中國新疆傳統發酵酸奶中分離出來的，由東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室保藏。前期實驗研究發現該菌株具產黏性能強及所產酸奶品質優良等特點，適合于制備高品質直投式發酵劑[14]。為更加深入分析該菌株合成ESP的遺傳基礎，本研究首先通過二代測序技術對該菌株進行基因組測序，基于生物信息學分析該菌株的糖代謝能力及EPS基因簇，同時利用API 50CH測定該菌株的糖發酵情況，并采用高效離子交換色譜法測定EPS的單糖組成。為研究該菌株EPS遺傳基礎與EPS結構之間關系及后續更加合理地應用該菌株提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜熱鏈球菌KLDS3.1012由東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室工業微生物菌種保藏中心（KLDSDICC）提供，且通過16S rRNA基因測序鑒定。

M17肉湯培養基 青島高科園海博生物技術有限公司；細菌基因組提取試劑盒 北京天根生物技術有限公司；API 50CH 法國梅里埃公司；DEAE-Sepharose Fast Flow和Sepharose CL-6B填料 美國GE醫療生命科學公司；無水乙醇 天津市天力化學試劑有限公司；三氯乙酸、三氟乙酸 天津市大茂化學試劑廠；重蒸苯酚北京博奧拓達科技有限公司；濃硫酸 哈爾濱理工化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LDZF-50KB-II立式蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；CJ-2D超凈工作臺 天津泰斯特儀器有限公司；DHP-927型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；透析袋 北京索萊寶生物科技有限公司；蛋白純化儀美國GE醫療生命科學公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化及基因組提取

將甘油保藏的菌株KLDS3.1012以2%的體積分數接種于M17液體培養基，42 ℃培養24 h，連續轉接兩次，第3次培養12 h后用于基因組提取。按照細菌基因組提取試劑盒說明書的步驟提取菌株KLDS3.1012的基因組。

1.3.2 全基因組測序及組裝

利用Illumina HiSeq（2×100 bp配對末端文庫）和Illumina MiSeq（2×250 bp配對末端文庫）平臺組合測序技術對菌株KLDS3.1012進行基因組測序。通過進行質量控制和數據過濾，利用SOAPdenovo 2.0對所有有效數據（Clean Data）進行組裝[15]。

1.3.3 基因組注釋

采用NCBI原核生物基因組注釋流程（prokaryotic genome annotation pipeline，PGAP，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK174280/）進行基因預測及注釋。基因組中蛋白序列通過WebMGA網站進行COG（Cluster of Orthologous Group）注釋[16]。

1.3.4 生物信息學分析

利用CGView Server構建基因組圖譜[17]。糖代謝途徑參照KEGG通路數據庫進行分析[18]。ISfinder用于鑒定基因組序列中的轉座酶[19]。使用ACT（Artemis Comparison Tool）軟件對菌株KLDS3.1012與嗜熱鏈球菌ND03的EPS基因簇進行分析[20]。

1.3.5 表型特征的測定

采用API CHL培養基和API 50CH測試條按照試劑盒說明書測定菌株KLDS3.1012的碳水化合物利用情況。按照邵麗[21]所述的實驗步驟，提取菌株KLDS3.1012所產的EPS。參考Ren Wei等[22]的方法利用DEAESepharose Fast Flow和Sepharose CL-6B對EPS進行純化。參照邵麗[21]的方法，使用高效離子交換色譜（high performance anion exchange chromatography，HPAEC）法進行單糖組成的測定。

1.4 數據處理

利用HPAEC測定各標準品的保留時間和峰面積，以各濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。對樣品中各單糖的峰面積進行積分，根據標準曲線計算相應的濃度。

2 結果與分析

2.1 基因組的基本特征及注釋

圖1 嗜熱鏈球菌KLDS3.1012的基因組圈圖Fig. 1 Circular genome map of S. thermophilus KLDS3.1012

菌株KLDS3.1012的基因組序列已提交到GenBank數據庫，登錄號為：NZ_LHSK01000000。通過CGView Server構建其基因組圈圖（圖1）并利用PGAP流程進行注釋，一共預測出1 992 個基因，其中包括1 705 個蛋白編碼基因，213 個假基因，15 個rRNA，55 個tRNA和4 個ncRNA。

菌株KLDS3.1012的親緣關系報告（表1）顯示，菌株KLDS3.1012與嗜熱鏈球菌ND03在基因組序列最為相似（99.572 2%），親緣關系最近，而與嗜熱鏈球菌M17PTZA496的基因組序列差異較大，對稱一致性僅為83.842 8%。

表1 嗜熱鏈球菌親緣關系報告Table 1 Genome neighbor report of S. thermophilus strains

2.2 糖代謝能力分析

2.2.1 糖轉運系統

菌株KLDS3.1012不僅含有HPr（AKL23_RS05975）和EI（AKL23_RS05970），還含有10 個糖特異性通透酶（EII）的基因，其中包括蔗糖通透酶EII的基因、PTS果糖通透酶EII、PTS甘露糖通透酶EII和PTS葡萄糖通透酶EII（表2）。然而，PTS葡萄糖通透酶EII是由假基因編碼的，而另外2 個EII基因也不完整，因此不能通過PTS轉運葡萄糖。在菌株KLDS3.1012的基因組中鑒定到乳糖/半乳糖滲透酶（AKL23_RS06545）和葡萄糖滲透酶（AKL23_RS04150）。由于編碼ABC型糖轉運系統的基因不完整，因此ABC型糖轉運系統不能將糖轉運到菌株KLDS3.1012的細胞質中。綜上所述，從基因組分析，菌株KLDS3.1012可以利用蔗糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和乳糖。

表2 嗜熱鏈球菌KLDS3.1012的PTS相關基因Table 2 Putative genes related to phosphotransferase system (PTS) in S. thermophilus KLDS3.1012

2.2.2 糖核苷酸的合成途徑

被轉運到細胞質中的糖會通過各種代謝途徑生成糖核苷酸。如圖2所示，菌株KLDS3.1012可以通過β-半乳糖苷酶（AKL23_RS06540）水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖，一方面，半乳糖通過UDP-半乳糖的途徑（AKL23_RS06565和AKL23_RS06560）轉化生成UDP-半乳糖和Leloir途徑轉化生成葡萄糖-1-磷酸。另一方面，葡萄糖被葡萄糖激酶（AKL23_RS03575）磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，再由磷酸變位酶（AKL23_RS03880）進一步形成葡萄糖-1-磷酸。葡萄-1-磷酸作為重要的中間產物，它可以通過UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（AKL23_RS08610）轉化成UDP-葡萄糖或通過一系列酶促反應（AKL23_RS05870、AKL23_RS05860、AKL23_RS05865、AKL23_RS03055和AKL23_RS06935）生成dTDP-鼠李糖。編碼UDP-葡萄糖4-差向異構酶的基因具有3 個拷貝（AKL23_RS05370、AKL23_RS06390和AKL23_RS06555），這可能與UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖之間的相互轉換相關。甘露糖、果糖和蔗糖轉運到細胞質中后分別被磷酸化形成甘露糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸和蔗糖-6-磷酸，三者之間可以相互轉化（AKL23_RS08125、AKL23_RS08110和AKL23_RS10365）。隨后，果糖-6-磷酸由AKL23_RS04205、AKL23_RS05900和AKL23_RS02810編碼的一系列酶轉化成UDP-N-乙酰葡糖胺。總之，從基因組分析，菌株KLDS3.1012能夠形成4 種糖核苷酸，即UDP-葡萄糖、dTDP-鼠李糖、UDP-半乳糖和UDP-乙酰葡糖胺。這些糖核苷酸可以形成EPS的重復單元，再通過EPS基因簇形成EPS。

圖2 嗜熱鏈球菌KLDS3.1012糖核苷酸的合成Fig. 2 Synthesis of sugar nucleotides in S. thermophilus KLDS 3.1012

2.3 EPS基因簇的生物信息學分析

如圖3所示，菌株KLDS3.1012存在1 個EPS合成基因簇（圖4），由35 個基因組成。在該基因簇中的5'末端存在1 個嘌呤核苷磷酸化酶的編碼基因deoD（AKL23_RS05125），該基因存在于大部分EPS基因簇附近[23-24]。基因AKL23_RS05120、AKL23_RS05115、AKL23_RS05110和AKL23_RS05105分別負責編碼EPS的合成調節、鏈長決定和輸出相關的保守基因。AKL23_RS05100編碼的起始糖基轉移酶，可以將UDP-半乳糖轉移到脂質載體上。負責編碼其他糖基轉移酶的基因分別是AKL23_RS05095（假基因）、AKL23_RS05070、AKL23_RS05025（UDP-N-乙酰葡糖胺轉移酶），AKL23_RS05020、AKL23_RS05015和AKL23_RS05000，這些糖基轉移酶編碼基因對決定EPS的單糖組成起到關鍵的作用。AKL23_RS05055編碼的翻轉酶具有將重復單位輸出的功能。AKL23_RS004985編碼的orf14.9與生長功能相關，該基因也存在于其他嗜熱鏈球菌的EPS基因簇中[25]。AKL23_RS004980和AKL23_RS004960分別編碼磷酸酶和通透酶。此外，該基因簇中還存在3 個磷酸甘油酸變位酶的編碼基因（AKL23_RS004975、AKL23_RS004970和AKL23_RS004965）。

圖3 嗜熱鏈球菌KLDS3.1012的EPS基因簇Fig. 3 Exopolysaccharides gene cluster in S. thermophilus KLDS3.1012

前面的基因組親緣關系研究表明，菌株KLDS3.1012與嗜熱鏈球菌ND03的基因組序列親緣關系最近，高達99.57%。通過ACT工具對2 株菌的EPS基因簇序列進行比對分析，由圖4可知，菌株KLDS3.1012 EPS基因簇與嗜熱鏈球菌ND03的EPS基因簇具有很高的同源性，僅存在7 個倒置區域，而且中間的空白區域是由于菌株KLDS3.1012的gap造成的。

圖4 嗜熱鏈球菌KLDS3.1012 EPS基因簇的比對分析Fig. 4 Alignment of exopolysaccharides gene cluster in S. thermophilus KLDS3.1012

2.4 碳水化合物代謝能力

API 50CH碳水化合物代謝結果（圖5）表明，菌株KLDS3.1012可以代謝半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖和蔗糖。雖然與其他嗜熱鏈球菌碳水化合物代謝能力存在差異，但是菌株KLDS3.1012在碳水化合物利用方面，遺傳分析與表型結果是相一致的。

圖5 嗜熱鏈球菌KLDS3.1012的API 50CH發酵結果Fig. 5 Results of API 50CH test strip on S. thermophilus KLDS3.1012

2.5 EPS的單糖組成

菌株KLDS3.1012所產的EPS通過DEAE-Sepharose Fast Flow和Sepharose CL-6B進行兩步純化，隨后經三氟乙酸水解，最后用高效離子色譜測定EPS的單糖組成。由圖6可知，菌株KLDS3.1012所產的EPS由鼠李糖、半乳糖和葡萄糖以2.6∶1.7∶1的物質的量比組成。在單糖組成中沒有發現UDP-N-乙酰葡糖胺，然而，生物信息學分析表明菌株KLDS3.1012可以形成UDP-N-乙酰葡糖胺并且擁有UDP-N-乙酰葡糖胺轉移酶，這可能是由于相關基因表達水平的不足造成的，還需要進一步的研究驗證這一點。

圖6 嗜熱鏈球菌KLDS3.1012的EPS單糖離子色譜圖Fig. 6 HPAEC profile of monosaccharide composition of EPS from S. thermophilus KLDS3.1012

3 討 論

嗜熱鏈球菌作為重要的發酵劑，從功能上看，嗜熱鏈球菌在治療乳糖不耐癥、抗氧化、改善腸道免疫反應和緩解一些癌癥方面起著至關重要的作用[26]。從代謝能力上看，嗜熱鏈球菌不僅能夠代謝碳水化合物形成乳酸，酸化乳制品，還能形成糖核苷酸產生EPS[27-28]。嗜熱鏈球菌所產的EPS具有結構復雜和功能多樣的特點，因此作為近年來的持續熱點問題。隨著基因組測序技術的發展，研究人員可以利用生物信息學的手段充分挖掘嗜熱鏈球菌所合成的EPS的相關分子元件，為揭示嗜熱鏈球菌合成EPS的機理及調控提供基礎。Bolotin等[29]研究了嗜熱鏈球菌CNRZ1066和LMG13811的糖代謝相關遺傳基礎；Sun Zhihong等[30]完成了ND03的全基因組測序并對其獨特的EPS基因簇進行分析；Wu Qinglong等[23]通過嗜熱鏈球菌ASCC 1275的EPS基因簇分析，發現該菌株高產EPS的相關基因；Bai Ying等[31]報道了嗜熱鏈球菌MN-BM-A01的EPS產量和相關基因的分析；Vendramin等[32]對8 株已完成基因組測序的嗜熱鏈球菌epsA基因的啟動子進行了比較基因組學分析。本研究不僅從生物信息學層面分析了菌株KLDS3.1012的糖代謝能力及EPS基因簇，同時還利用API 50CH測定該菌株的糖發酵情況及采用高效離子交換色譜法測定EPS的單糖組成，為研究EPS的基因與結構奠定了基礎。

雖然嗜熱鏈球菌在糖代謝水平上相對保守，然而不同的嗜熱鏈球菌菌株的糖代謝情況并不一致，嗜熱鏈球菌基本都可以利用葡萄糖、乳糖和果糖[33]，而半乳糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、蜜二糖和棉子糖的利用卻有菌株特異性[34-35]，如嗜熱鏈球菌AR333可以利用葡萄糖、乳糖和蔗糖[22]，嗜熱鏈球菌MTCC 5461可以利用17 種碳水化合物[36]，而本研究中的菌株KLDS3.1012可以利用半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖和蔗糖。能夠利用半乳糖是工業發酵菌株的優良性狀，可以避免半乳糖的過量積累而影響發酵乳制品的質量。此外，利用半乳糖可以提高EPS的產量，因為半乳糖可以形成糖核苷酸。嗜熱鏈球菌所產EPS的單糖組成及比例也都不一樣，AR333和GST-6所產的EPS都由半乳糖和葡萄糖組成，但是物質的量比差異較大[5,22]，DGCC 7785所產的EPS由半乳糖、葡萄糖和N-乙酰半乳糖胺組成[37]，而本研究中的KLDS3.1012所產的EPS由鼠李糖、半乳糖和葡萄糖，與嗜熱鏈球菌DGCC 7698所產的EPS具有相似性[37]。

糖核苷酸作為合成EPS的活性前體，是合成EPS的關鍵底物[11]。在分析菌株KLDS3.1012的糖核苷酸合成途徑中發現，在其基因組中，催化UDP-葡萄糖與UDP-半乳糖相互轉變的UDP-葡萄糖4-差向異構酶的編碼基因高達3 個拷貝，利于二者的靈活轉變，以滿足形成重復單元過程中對不同糖核苷酸的需求。嗜熱鏈球菌的EPS基因簇中參與指導EPS重復單元合成、鏈長、聚合與輸出的基因相對保守，而糖基轉移酶差別甚大，其具有多態性，目前，在51 株嗜熱鏈球菌中存在118 個糖基轉移酶，不同的糖基轉移酶可以轉移不同的糖核苷酸形成EPS的重復單元[38]，因此糖基轉移酶對EPS的結構起到決定性作用。本研究中菌株KLDS3.1012的糖基轉移酶中只鑒定出半乳糖核苷酸轉移酶和UDP-N-乙酰葡糖胺轉移酶，此外，該菌株的EPS基因簇與嗜熱鏈球菌ND03的EPS基因簇具有很高的同源性。

4 結 論

從基因組水平分析，菌株KLDS3.1012具有半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖和蔗糖轉運系統和4 種糖核苷酸（UDP-葡萄糖、dTDP-鼠李糖、UDP-半乳糖和UDP-N-乙酰葡糖胺）合成的相關基因及1 個胞外多糖合成基因簇。表型測定結果表明菌株KLDS3.1012可以利用以上6 種碳源并能形成由鼠李糖、半乳糖和葡萄糖組成的EPS。