發(fā)酵酸菜來源乳酸菌的益生特性及其在發(fā)酵乳中的應用

趙圣明，趙巖巖，馬漢軍，潘潤淑

（1.河南科技學院食品學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省畜禽產(chǎn)品精深加工與質量安全控制工程技術研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003）

益生菌被定義為“寄生于宿主體內活的微生物，當其生長達到一定數(shù)量后能夠對宿主的健康有益”的一類微生物。益生菌可通過改善免疫應答，促進有害物質的代謝以及產(chǎn)生抗菌物質和益生物質（如維生素、多糖等）等來發(fā)揮其益生作用[1]。目前研究較多的益生菌基本為乳桿菌屬和雙歧桿菌屬，尤其是乳桿菌屬作為人體腸道及口腔內部最常見的共生菌群，因是人體小腸內的最主要菌群，能夠顯著地抑制腸道內有害菌的生長，已被確定為是非常具有應用價值的益生菌[2-3]。使用乳酸菌發(fā)酵食物和飲料已經(jīng)有數(shù)千年的歷史，表明其是安全的食品級微生物[4-5]。乳酸菌可以通過產(chǎn)生一些抗菌物質（如乳酸和細菌素等）抑制致病菌的生長，這是篩選益生菌的一個主要因素。然而，篩選具有應用前景的益生菌還需要考慮一些其他因素[1]。例如菌株對胃腸道低酸和膽鹽等不良環(huán)境的耐受性能力也是其在人體內發(fā)揮益生作用的前提條件，如果益生菌不能夠順利地進入到小腸內進行定殖，就無法發(fā)揮其益生作用。而研究益生菌的體內活性成本高且費時，因此一般采取體外實驗對其益生活性進行研究。此外，每一個菌株都必須進行相關特性的體外評價，因為不同的益生菌株之間存在著高度的特異性[6]。

發(fā)酵食品是獲得益生菌的一個良好來源，尤其是中國一些傳統(tǒng)的發(fā)酵食品如藏靈菇[7]、酸菜[8]等均可以分離獲得具有應用潛力的益生菌。盧海強等[8]從東北酸菜中篩選得到具有益生特性的屎腸球菌HS38，具有較好的亞硝酸鹽降解能力和抗氧化能力等。Yu Zhihui等[9]從發(fā)酵酸菜中篩選到的植物乳桿菌S2-5和S4-1具有較好的體外益生活性，且能有效降低小鼠體內膽固醇含量。陳明等[10]從青藏高原牦牛酸奶中篩選得到對大鼠體內具有較好益生特性的植物乳桿菌XM5，可使衰老性大鼠肝臟中的谷胱甘肽過氧化物酶和血清中的總超氧化物歧化酶的活力顯著提高。本研究前期從東北農家酸菜中分離獲得49 株對食品中常見的腐敗性及致病性芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和嗜熱脂肪地芽孢桿菌等）具有較好抑菌作用的乳酸菌菌株，現(xiàn)對分離得到的乳酸菌菌株的益生活性進行研究，分析其體外的耐酸能力、耐膽鹽能力、疏水能力、黏附能力等，旨在從中篩選得到具有潛在益生特性的菌株，為其在發(fā)酵食品中的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種由河南科技學院食品學院食品微生物實驗室保藏。

商業(yè)酸奶發(fā)酵劑 北京川秀國際貿易有限公司；牛膽鹽、胰酶 北京索萊寶科技有限公司；改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modification of Eagle's medium，DMEM） 美國Gibco公司；細菌基因組提取試劑盒 美國Omega公司；DNA凝膠回收試劑盒、柱式質粒提取試劑盒 大連TaKaRa生物公司；pMD19-T連接試劑盒、Taq Mix 南京諾唯贊生物公司；DNA標準分子質量Marker 南京金斯瑞公司；乳酸菌培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基）、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

Sartious電子精密天平 北京賽多利斯天平有限公司；SW-CJ-IBU超凈工作臺 蘇州蘇凈集團；5418高速離心機 芬蘭Eppendorf公司；Orion 3 STAR pH計美國Thermo公司；GXZ-9240 MBE鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；冷凍干燥機 德國Christ公司；Eclipse 80i光學顯微鏡 日本Nikon公司；HYL-A多功能搖床 太倉強樂實驗儀器有限公司；PTC100TM聚合酶鏈式反應基因擴增（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國MJ Research公司；PowPacTMHC164-5052高電流電泳儀 美國Bio-Rad生命醫(yī)學產(chǎn)品公司；JS-380C全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株酸耐受性測定

以前期獲得的對食品中常見腐敗性及致病性芽孢桿菌具有較好抑菌活性的49 株菌進行酸耐受性實驗。將供試菌以1%的接種量接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h，菌濃度約為5.4×108CFU/mL。然后4 ℃、5 000×g離心10 min后收集菌體，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌兩次后重懸于PBS中。再用2 mol/L的HCl溶液將乳酸菌菌懸液pH值分別調至2.5。分別在0、1、2、3 h取樣吸取1 mL的菌懸液進行梯度稀釋，選取合適的稀釋度進行平板涂布菌落計數(shù)。

1.3.2 菌株膽鹽耐受性測定

將供試菌株以1%的接種量接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h，菌濃度約為6.3×108CFU/mL。然后4 ℃、5 000×g離心10 min后收集菌體，用PBS洗滌2 次后重懸于PBS中。將乳酸菌菌懸液分別置于含0.3%、0.5%和1%牛膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基中。分別孵育3 h后取樣，吸取1 mL的菌懸液進行梯度稀釋，選取合適的稀釋度進行平板涂布菌落計數(shù)。

1.3.3 菌株的分子生物學鑒定

將目標菌株以1%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃過夜培養(yǎng)12 h后，取5 mL菌液經(jīng)9 000×g離心2 min后棄上清液得菌體，采用TE緩沖液離心洗滌2 次，最后采用OMEGA公司的細菌基因組提取試劑盒提取基因組。采用原核生物16S rRNA擴增的通用引物[11]（由生工生物工程（上海）股份有限公司合成），正向引物fD1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物rP1：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增得到的目的片段經(jīng)連接到T載體轉化到大腸桿菌DH5α中，然后挑取轉化子送去南京金斯瑞生物公司測序，將所得到的16S rRNA基因序列，在www.ncbi.nlm.nlh.gov網(wǎng)站中使用BLASTN2.211[MAY-05-2005]在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB基因庫中進行同源性搜索比對。

1.3.4 菌株黏附能力測定

將供試菌株以1%的接種量經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，經(jīng)傳代活化后培養(yǎng)至對數(shù)期，然后4 ℃、5 000×g離心10 min后收集菌體，用PBS洗滌兩次后重懸于DMEM培養(yǎng)液中，將菌體的使用濃度調整到約為6.2×108CFU/mL。將Caco-2細胞采用含有10%熱滅活胎牛血清、青霉素100 μg/mL和鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換一次培養(yǎng)液。待細胞貼壁生長為單層后，用0.25%的胰蛋白酶消化后重懸于DMEM培養(yǎng)液中，將細胞濃度調整約為4.5×105個/mL。將制備好的細胞懸液置于24 孔的細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)長成單層細胞。然后將100 μL 5×108CFU/mL的乳酸菌菌懸液和900 μL的DMEN培養(yǎng)液加進入細胞培養(yǎng)孔內，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min后，采用PBS清洗細胞數(shù)次，除去未黏附于細胞表面的菌體。然后加入1 mL Triton 100（體積分數(shù)1%）使黏附的菌體與細胞分離，將培養(yǎng)液經(jīng)適當稀釋后涂布于MRS平板上進行菌落計數(shù)。每組實驗做3 個平行，通過式（1）計算乳酸菌對細胞的黏附率：

1.3.5 菌株疏水性測定

將供試菌株培養(yǎng)到穩(wěn)定期后經(jīng)5 000×g離心10 min后收集菌體，用PBS洗滌兩次后重懸于0.1mol/L的KNO3（pH 6.2）溶液中，將菌體的使用濃度調整到5.6×108CFU/mL，在600 nm波長下測定菌懸液的吸光度（A0）。然后分別取1 mL的二甲苯、乙酸乙酯和氯仿與3 mL的菌懸液混合后室溫放置10 min混勻，再靜止放置20 min后于600 nm波長處測定吸光度（A1）。通過式（2）計算乳酸菌黏附有機溶劑的百分比，以計算結果表示乳酸菌的疏水性：

1.3.6 菌株自凝聚測定

將供試菌株菌懸液的濃度調整為在600 nm波長處OD值約為1.0，分別取4 mL置于10 mL的試管中，在室溫條件下靜止放置待其分層，分別靜置1、3、5 h后吸取1 mL上層懸液測OD600nm值，分別記作OD1、OD3、OD5，每個實驗做3 個平行。細菌自凝聚率按式（3）計算：

式中：OD0和ODt分別代表自凝聚前、后上層懸液在600 nm波長處測量所得的OD值。

1.3.7 菌株溶血活性測定

將供試菌株以1%的接種量經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)12 h后，穿刺接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h后觀察是否有溶血圈出現(xiàn)，判斷供試菌株是否具有溶血活性。

1.3.8 菌株在發(fā)酵乳中產(chǎn)酸能力測定

將待測菌株以3%的添加量接種于脫脂乳中，經(jīng)42 ℃培養(yǎng)6 h后測定發(fā)酵乳的pH值。

1.3.9 發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)的測定

將商業(yè)發(fā)酵劑和待測菌株分別以0.1%和5%的添加量對滅菌牛奶進行發(fā)酵，待其發(fā)酵pH值降低到4.5時停止發(fā)酵，放入4 ℃冰箱冷藏。分別在發(fā)酵乳發(fā)酵后的第0、1、3、5、7天時，采用平板計數(shù)法對發(fā)酵乳中的乳酸菌活菌數(shù)進行檢測。

1.3.10 發(fā)酵乳pH值和滴定酸度的測定

采用數(shù)顯pH計測定發(fā)酵乳的pH值。滴定酸度的測定：取發(fā)酵乳樣品10 g，加入20 mL蒸餾水混合均勻后，放入0.5 mL 0.5%酚酞作為指示劑，采用0.1 mol/L的NaOH溶液進行滴定。消耗0.1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液相當于1 °T。

1.3.11 發(fā)酵乳持水性的測定

持水性測定：30 mL發(fā)酵乳置于50 mL離心管中，4 ℃、4 500×g條件下離心18 min，每個樣品平行做3 次。以式（4）用于計算發(fā)酵液的持水性：

式中：M1為離心之后乳清的質量/g；M2為所有發(fā)酵乳的質量/g。

1.3.12 發(fā)酵乳黏度的測定

將發(fā)酵乳置于室溫（25 ℃）一段時間后，采用數(shù)顯黏度測定儀測定發(fā)酵乳的黏度，參數(shù)設定為25 ℃，0#轉子進行測定，其中轉子轉速15 r/min、扭矩10%～100%、測定時間30 s，每個樣品平行做3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件進行分析，所有實驗重復3 次，實驗結果以 ±s表示，顯著性分析采用Duncan檢驗。

2 結果與分析

2.1 供試乳酸菌菌株酸耐受性篩選結果

益生乳酸菌進入體內能否通過胃酸的消化作用進入腸道是其發(fā)揮益生作用的重要影響因素。在pH 3.0環(huán)境中消化1.5～3 h后菌株的存活被認為是衡量菌株耐酸性的標準之一[12-13]。胃的排空時間一般也在3 h以內，因此本實驗為能更好模擬真實的胃酸情況，選取略低的pH 2.5對菌株進行耐酸性實驗，結果見表1。測試的49 株乳酸菌均可以在pH 2.5的條件下存活。但是不同菌株經(jīng)過不同時間處理后的活菌數(shù)差別較大。在pH 2.5條件下處理1 h后38 株菌的活菌數(shù)基本保持不變，活菌數(shù)仍可以維持在約7～8（lg（CFU/mL）），11 株菌的活菌數(shù)發(fā)生下降，活菌數(shù)約為6～7（lg（CFU/mL））。在pH 2.5的條件下經(jīng)過2 h的處理后，16 株菌的活菌數(shù)降到5（lg（CFU/mL））以下，20 株菌的活菌數(shù)降低到約6～7（lg（CFU/mL）），4 株菌的活菌數(shù)降低到5～6（lg（CFU/mL）），有9 株菌的活菌數(shù)基本保持不變。在pH 2.5的條件下經(jīng)過3 h處理后，24 株菌的活菌數(shù)降低到5（lg（CFU/mL））以下，13 株菌的活菌數(shù)降低到5～6（lg（CFU/mL）），9 株菌的活菌數(shù)降低到6～7（lg（CFU/mL）），3 株菌的活菌數(shù)基本保持不變。

表1 不同的乳酸菌株對低酸和膽鹽的耐受性結果Table 1 Tolerance to low acid and bile salt of different strains of lactic acid bacteria

2.2 供試乳酸菌菌株膽鹽耐受性篩選結果

如表1所示，測試的49 株乳酸菌中，在0.3%膽鹽處理3 h的條件下7 株菌完全不能存活，14 株菌的活菌數(shù)基本保持不變，活菌數(shù)仍可以維持在7～8（lg（CFU/mL）），9 株菌的活菌數(shù)明顯下降，活菌數(shù)降低到5（lg（CFU/mL））以下。經(jīng)過0.5%膽鹽處理3 h后，28 株菌完全不能存活，2 株菌的活菌數(shù)基本保持不變，活菌數(shù)仍可以維持在7～8（lg（CFU/mL）），7 株菌的活菌數(shù)降低到6～7（lg（CFU/mL）），12 株菌的活菌數(shù)降低到5（lg（CFU/mL））以下。經(jīng)過1%膽鹽處理3 h后，39 株菌完全不能存活，1 株菌的活菌數(shù)降低到6～7（lg（CFU/mL）），9 株菌的活菌數(shù)降低到5（lg（CFU/mL））以下。

根據(jù)對49 株乳酸菌菌株的低酸和膽鹽耐受性篩選，本研究最終篩選獲得6 株（A16、A44、B51、B54、B72和C53）進一步分析其益生特性。

2.3 乳酸菌菌株的分子生物學鑒定結果

經(jīng)16S rRNA測序的方法獲得6 株乳酸菌的16S rRNA基因，分別為A16（1 522 bp）、A44（1 482 bp）、B51（1 578 bp）、B54（1 566 bp）、B72（1 494 bp）、C53（1 547 bp）。選取GenBank中相似性較高菌株的16S rDNA基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。最終確定菌株A16和B72為戊糖乳桿菌，A44、B51、B54和C53為植物乳桿菌。

2.4 菌株疏水性

圖1 乳酸菌菌株的疏水性Fig. 1 Hydrophobicity of different strains of lactic acid bacteria

疏水性較高的菌株，可能會對小腸組織具有較高的黏附能力，本實驗測定了6 株乳酸菌對二甲苯、乙酸乙酯和氯仿的疏水能力。由圖1可以看出，所有菌株均表現(xiàn)出一定的疏水性，不同菌株的疏水性差異較大。二甲苯是一種非極性溶劑，除了菌株B72，其余5 株菌均表現(xiàn)出對二甲苯較高的疏水性（＞50%），說明這些菌株都具有疏水的細胞表面。氯仿是酸性溶劑，屬于電子受體，而乙酸乙酯是單堿性溶劑，屬于電子供體。供試的6 株乳酸菌對氯仿的疏水性都明顯高于對乙酸乙酯的疏水性，尤其是菌株A16和A44對氯仿的疏水性均大于80%，說明這幾株菌都是電子供體。

2.5 菌株黏附能力

益生菌對腸道細胞的黏附能力是篩選益生菌的一個重要參考因素。Caco-2細胞系是分離自人結腸癌細胞的一株細胞，以表皮吸附的方式生長，在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下，可以表現(xiàn)出成熟腸道所具有的特征。本實驗應用Caco-2細胞系作為體外實驗模型研究6 株菌對腸上皮細胞的黏附特性，結果見圖2。6 株菌的黏附能力存在比較明顯的菌株特異性（P＜0.05）。其中菌株A44有13.57%的菌體可以黏附到細胞上，黏附能力最強。菌株A16和B54的黏附率分別為11.24%和10.84%。菌株B51、B72和C53黏附能力相對較差，黏附率分別為5.76%、7.62%和9.32%。

圖2 乳酸菌對Caco-2細胞的黏附率Fig. 2 Adhesion of different strains of lactic acid bacteria to Caco-2 cells

2.6 菌株自凝聚能力

圖3 乳酸菌菌株的自凝聚率Fig. 3 Auto-aggregation ability of different strains of lactic acid bacteria

如圖3所示，菌株懸液的自凝聚率隨著靜置時間的延長而逐漸增大，且不同的菌株間自凝聚率具有明顯的差異。其中菌株A44和B54在靜置3 h后較其他菌株表現(xiàn)出更好的自凝聚能力，5 h后菌株A44和B54的自凝聚率超過了60%，而A16和C53也表現(xiàn)出較好的自凝聚率，自凝聚率均超過40%。

2.7 菌株溶血活性

溶血活性是篩選益生菌的重要因素，不具有溶血活性才能將其認為是安全的益生菌。圖4結果表明，6 株供試菌株在哥倫比亞血平板上生長均未形成溶血圈。說明這6 株乳酸菌均不具有溶血活性。

2.8 植物乳桿菌A44產(chǎn)酸能力測定結果

綜合以上功能特性的研究結果表明植物乳桿菌A44具有最好的功能活性，因此本實驗選取菌株植物乳桿菌A44用于下一步發(fā)酵乳的研究。脫脂乳經(jīng)植物乳桿菌A44發(fā)酵6 h后測得發(fā)酵pH值為5.97，表明植物乳桿菌A44在乳中的產(chǎn)酸能力較差，不適合單獨作為發(fā)酵劑制作發(fā)酵乳，但是可以作為輔助發(fā)酵劑與商業(yè)發(fā)酵劑進行復配使用提高發(fā)酵乳的益生功能。

2.9 發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)的測定結果

表2 冷藏期間活菌數(shù)變化Table 2 Change in viable bacterial count during storage

如表2所示，經(jīng)4 ℃冷藏7 d后，添加植物乳桿菌A44混合發(fā)酵的樣品活菌數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05），表明植物乳桿菌A44對商業(yè)發(fā)酵劑中的菌株生長無影響，并能提高發(fā)酵乳的活菌數(shù)。發(fā)酵乳冷藏的7 d內，活菌數(shù)沒有發(fā)生明顯的變化，說明植物乳桿菌A44在冷藏過程中可以保持較好的存活能力，因此具有作為輔助發(fā)酵劑生產(chǎn)益生發(fā)酵乳的潛力。

2.10 發(fā)酵乳pH值和滴定酸度測定結果

圖5 發(fā)酵乳冷藏期間pH值和滴定酸度變化情況Fig. 5 Changes in pH and titrable acidity of yogurts during storage

由圖5可知，在4 ℃冷藏7 d期間，兩個發(fā)酵乳樣品的pH值均隨著時間的延長呈緩慢下降趨勢，而滴定酸度隨著時間的延長呈上升趨勢。添加植物乳桿菌A44與商業(yè)發(fā)酵劑復合發(fā)酵的處理組pH值和滴定酸度與單獨用商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵的對照組相比無顯著差異（P＞0.05），這可能是因為植物乳桿菌A44在乳中生長的產(chǎn)酸能力較差，表明將植物乳桿菌A44以輔助發(fā)酵劑添加到發(fā)酵乳中對產(chǎn)品冷藏期間pH值和滴定酸度基本不產(chǎn)生影響。

2.11 發(fā)酵乳持水性測定結果

發(fā)酵乳的持水性越好，發(fā)酵乳的凝膠結構中束縛的水分越多，使發(fā)酵乳能夠保持較好的口感[14]。由圖6可知，在4 ℃冷藏7 d期間，2 個發(fā)酵乳樣品隨著時間的延長都保持著較好的持水能力，且將植物乳桿菌A44以輔助發(fā)酵劑添加到發(fā)酵乳中對產(chǎn)品冷藏期間持水性無顯著影響（P＞0.05）。

圖6 發(fā)酵乳冷藏期間持水性變化情況Fig. 6 Changes in water-holding capacity of yogurts during storage

2.12 發(fā)酵乳黏度測定結果

圖7 發(fā)酵乳冷藏期間黏度變化情況Fig. 7 Changes in viscosity of yogurts during storage

由圖7可知，4 ℃冷藏7 d期間，隨著時間的延長兩組發(fā)酵乳的黏度都呈上升趨勢，主要是因為冷藏過程中，部分游離的凝乳微粒重新聚集到凝乳微粒的網(wǎng)狀結構中，從而提高發(fā)酵乳的黏度。本實驗中，在冷藏7 d內復合發(fā)酵處理組的黏度都高于對照組的黏度，這可能是由于植物乳桿菌A44在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生胞外多糖從而提高了發(fā)酵乳的黏度[15]。

3 討 論

益生菌經(jīng)攝食進入人體后，可以通過改善腸道菌群[16]、提高人體免疫活性[17]以及降低膽固醇[18]等對人體的健康起到有效的促進作用。因此，目前關于功能性益生菌的研究受到了越來越多的關注，尤其是從傳統(tǒng)的發(fā)酵食品中篩選安全的功能益生菌已經(jīng)成為一個研究熱點。本研究前期從東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中分離得到49 株對食品中常見的腐敗性及致病性芽孢桿菌具有較好抑菌活性的乳酸菌菌株，本實驗采用體外篩選的方法從這49 株中篩選得到6 株對酸及膽鹽具有較好耐受性的乳酸菌，體外研究其益生活性，期望其在功能性乳品中得到開發(fā)和應用。

益生乳酸菌經(jīng)口服進入人體后，必須能夠抵抗胃酸和腸道的高膽鹽環(huán)境，以及具有良好的腸道黏附性能才能夠最終定殖于腸道發(fā)揮其益生作用。因此益生乳酸菌的篩選必須要具有耐低酸及高膽鹽環(huán)境的能力，這樣才能保證其在人體內發(fā)揮益生作用。Caggia等[1]研究了一些分離自奶酪中的乳桿菌對低pH值和高膽鹽具有極好的耐受能力。陳明等[10]報道從牦牛酸奶中篩選得到的植物乳桿菌XM5具有較強的耐酸和耐膽鹽能力。Karasu等[19]也發(fā)現(xiàn)分離自發(fā)酵蔬菜中植物乳桿菌能夠耐受低酸和高膽鹽環(huán)境。本研究從49 株具有對芽孢桿菌具有較好抑菌活性菌株的耐酸及耐膽鹽活性進行篩選，結果有6 株菌能夠耐受pH 2.5的酸度及1%膽鹽添加量，說明這幾株菌具有較強的低酸及高膽鹽耐受性。目前已經(jīng)有研究報道稱乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生細菌素可能會提高菌株對膽鹽和酸的耐受性，因為細菌素對菌株在腸道內定殖及與腸道內其他菌株競爭有優(yōu)勢[20-21]，且Bove等[22]也在基因表達的研究方面進一步證實了這種說法。Yu Zhihui等[23]從中國東北的發(fā)酵酸菜中分離獲得了具有較好耐低酸和高膽鹽的植物乳桿菌菌株，本研究結果與其相一致，說明發(fā)酵酸菜中可以分離獲得對低酸和高膽鹽耐受性好的乳酸菌菌株。

疏水性是細菌與腸道表皮細胞相互吸附的重要指標之一，有研究表明，乳酸桿菌對宿主腸道細胞的黏附能力是呈正相關的。因此，本研究應用乙酸乙酯研究了乳酸菌菌株表面的對電子的接受能力以及應用氯仿研究菌株表面的電子供給能力。結果表明所有待測菌株都具有較強的電子供給能力，說明菌株都具有較強的疏水能力。通常研究認為疏水性高的菌株對細胞的黏附性也高，一般可以通過細菌表面疏水性測定來初步篩選高黏附活性的菌株，Caggia[1]和Xu[24]等關于乳酸菌益生活性的研究都證實了這一結果。但也有報道稱1 株疏水性僅為2%的嗜酸乳桿菌對HT29MTX細胞的黏附率為40%[25]。因此，疏水性可能會對黏附作用具有促進作用，但是疏水性好不能一定保證其對細胞具有強的黏附能力。

對腸上皮細胞的黏附能力被認為是評價益生菌的一個重要因素，已經(jīng)有很多研究表明不同分離來源的乳桿菌都對腸上皮具有較強的黏附能力，如L. rhamnosus GG、L. casei ssp. shirota和L. casei ssp. imunitass[26-27]。本研究結果表明不同的乳酸菌菌株對Caco-2細胞的黏附能力表現(xiàn)出明顯的差異，其中植物乳桿菌A44的活性最好，黏附率為13.57%，與文獻報道的高黏附性菌株相比，其黏附率不是特別好，例如具有優(yōu)良益生活性的鼠李糖乳桿菌LGG的黏附率最高可以達到30%。但是體外黏附率高也不能完全代表菌株在人體內的黏附能力，有很多具有良好益生特性并已經(jīng)成功應用于商業(yè)化的乳酸菌的體外黏附率也不高，例如干酪乳桿菌Shirota和嗜酸乳桿菌NCFB1748等[28-29]。Laprra等[30]研究表明采用Caco-2單層細胞測定黏附能力更接近體內實驗結果。研究認為，菌株體外實驗對細胞黏附率高，可能在體內黏附能力也會更好，但是體外對Caco-2細胞黏附能力不能完全用來評價菌株在體內的黏附特性，還要綜合更多的因素進行考慮。

本研究發(fā)現(xiàn)疏水率高、自凝聚率高的菌株對細胞黏附能力就越強，實驗結果表明菌株與細胞的黏附能力和其對有機溶劑的疏水性和自凝聚率呈正相關，這和以前Pithva等[31]的研究結果相一致。同時前人的研究也證明自凝聚力較強的菌株能夠在腸道細胞表面形成一層天然的屏障防止食源性致病菌定殖于腸道表面[32]。溶血活性是體外測定益生菌安全性的一個重要指標之一，具有溶血活性的細菌對人具有較強的致病能力。目前的研究發(fā)現(xiàn)，大部分乳酸菌均不具有溶血活性。也有研究報道稱部分乳酸菌菌株具有溶血活性，Argyri等[33]對73 株乳桿菌的溶血實驗研究發(fā)現(xiàn)其中4 株菌具有溶血活性，而具有溶血活性的乳桿菌較為罕見。本實驗的5 株益生菌均沒有溶血活性，說明其可以安全地應用于食品加工中。

4 結 論

本研究從分離自東北酸菜具有抑制食品中常見腐敗性及致病性芽孢桿菌活性的49 株乳酸菌中，篩選出6 株具有低酸和高膽鹽耐受性的菌株，通過16S rRNA分子生物學鑒定確定6 株乳酸菌中A16和B72為戊糖乳桿菌，A44、B51、B54和C53為植物乳桿菌。益生實驗結果表明植物乳桿菌A44具有較好的疏水性、黏附性及自聚率。研究確定本實驗篩選得到的益生菌株對Caco-2細胞的黏附能力與其對有機溶劑的疏水性和自聚率呈一定的相關性。在4 ℃冷藏7 d期間，植物乳桿菌A44作為輔助發(fā)酵劑添加后對商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵酸乳的pH值、滴定酸度和持水性等無顯著影響，但是可顯著提高發(fā)酵乳的活菌數(shù)和黏度（P＜0.05）。本研究結果為植物乳桿菌A44作為益生性發(fā)酵菌株的開發(fā)應用提供理論參考。