發酵溫度對柑橘酒品質的影響

畢靜瑩，李 華*，王 華*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.寧夏職業技術學院生物與制藥技術系，寧夏 銀川 750021）

2016年中國的柑橘栽培面積為255.67萬 公頃、產量3 618.80萬 t，分別為同期世界柑橘栽培面積（8 8 0.8 9萬 公頃）、產量（1 3 5 0 0萬 t）的2 9.0 2%和2 6.7 9%，我國柑橘栽培面積和產量已雙雙久居全球之冠[1]。如此大的柑橘種植面積和產量，深加工能力卻僅占產量的5%，低于世界平均水平35%，與中國臺灣80%～90%的加工水平更是相去甚遠[2]。

柑橘酒的“后苦”、高酸和香氣寡淡等感官缺陷，嚴重制約著其市場的推廣和生產規模的擴大。“后苦”即柑橘果實在經受凍害、擠壓碰撞、壓榨取汁后，在pH值小于6.5的條件下，柑橘果實中無苦味的前體物質檸檬苦素A-環內脂在檸檬苦素D-環內脂水解酶的作用下轉化成為具有苦味、閾值極低的檸檬苦素類似物[3]。香氣是評判果酒品質的一個重要感官指標，其主要包括醇類、酯類、酸類和醛酮類[4]等，構成果酒品種、發酵和陳釀香氣。柑橘酒香氣成分的種類、含量、閾值及其相互作用是影響柑橘酒風格和品質的主要因素，可作為感官評價的重要依據。

目前對柑橘酒的研究主要集中在3 個方面，首先是通過感官評價[5-6]、理化和衛生指標[7]、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[8-9]對柑橘酒香氣的檢測等方面指導工藝優化；其次是從柑橘果實表面[10-11]、橘園土壤[10-13]、自然發酵柑橘汁[13-15]、腐爛果實[16]和果肉[17]中分離篩選出適宜于柑橘酒釀造的專屬酵母；第三是柑橘與其他果品，例如蘋果[18]、石榴[19]、佛手[20]等進行復合果酒的釀造。而針對柑橘酒生產存在的實際問題，通過理化指標、顏色、香氣成分、“后苦”類物質種類及含量等感官指標的檢測和分析達到優化柑橘酒釀造溫度的研究鮮見報道。

本研究以四川渠縣產臍橙為原料，依據李華[21]小容器釀酒技術，手工剝皮、去籽后采用氣囊壓榨取汁，上清液中加入葡萄酒釀酒酵母，選擇10、14、18、22、26 ℃和30 ℃進行控溫發酵釀造柑橘酒。采用分光光度法檢測酒樣在450、520、570 nm和630 nm[22]波長處的吸光度，評價顏色；通過攪拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）法提取柑橘酒中的香氣成分，再輔助熱脫附-GC-MS聯用儀定性定量分析香氣成分構成和含量；利用超高效液相色譜法測定酒樣中“后苦”類物質的種類及含量。通過本研究了解發酵溫度對柑橘酒感官影響的基本規律，為優化釀造工藝、推廣及規模化生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臍橙（平均成熟度：可溶性固形物質量分數11.90%，總糖質量濃度（以葡萄糖計）58.46 g/L，總酸質量濃度（以檸檬酸計）7.20 g/L，pH 3.63，出汁率41.72%）于2014年12月底、2015年12月中旬采自四川渠縣華橙酒業有限公司柑橘園。

葡萄酒釀酒酵母BV818 安琪酵母股份有限公司；檸檬苦素、諾米林、2-辛醇（均為色譜純） 美國Sigma公司；氫氧化鈉、葡萄糖、五水合硫酸銅、酒石酸鉀鈉、鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）、偏重亞硫酸鉀廣東光華科技股份有限公司。甲醇、乙腈（均為色譜純）賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設備

PAL-1數字手持式折射儀 日本ATAGO公司；ET18滴定儀 梅特勒-托利多國際貿易有限公司；Cary 60 UV-Vis紫外分光光度計 安捷倫科技有限公司；5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；UPLC I-Class超高效液相色譜（配有二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站）、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、Sep-Pak Plus C18固相萃取小柱 美國Waters公司；85-2數顯恒溫磁力攪拌器 杭州儀表電機有限公司；TRACE DSQ GC-MS聯用儀 美國Thermo Finnigan公司；DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國J&W公司。

1.3 方法

1.3.1 釀造工藝流程

柑橘酒釀造工藝：原料采收→篩選→剝皮→壓榨與果核分離→發酵→陳釀。

操作要點：完熟柑橘原料，人工挑選出不合格果實及雜質，手工剝皮、去籽后，料理機打漿導入20 L干凈的廣口玻璃罐，加入50 mg/L SO2，采用小容器釀造法進行柑橘酒的釀造。在低于10 ℃的條件下澄清24～48 h，取上清液，升溫至設定溫度，按照200 mg/L添加活性干酵母，以發酵終乙醇體積分數12%～13%進行加糖，進行控溫發酵。當發酵液殘糖質量濃度低于2 g/L時倒罐，添加50 mg/L SO2，滿罐密閉10～14 d進行陳釀，陳釀過程中游離SO2保持在30～40 mg/L之間。

1.3.2 指標的測定

1.3.2.1 理化指標

總浸出物、還原糖（斐林試劑滴定法，以葡萄糖計）、滴定酸（氫氧化鈉滴定法，以檸檬酸計）、乙醇體積分數（密度瓶法）、pH值（pH計測定）、多酚（福林-肖卡法）的測定方法參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》及王華[23]方法。

1.3.2.2 檸檬苦素類似物

檸檬苦素類似物的提取：采用劉棠等[24]的方法，有改動。先用2.0 mL甲醇活化Sep-Pak Plus C18固相萃取小柱，再用2.0 mL去離子水平衡。將柑橘酒于10 ℃、8 000×g離心15 min后取1 mL上清液上樣于Sep-Pak Plus C18微固相萃取小柱，用1 mL去離子水淋洗后用1 mL 60%乙腈溶液進行洗脫，收集洗脫液，過0.22 μm濾膜后備用。

超高效液相色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），柱溫30 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量1.0 μL，流動相：乙腈-超純水（45∶55，V/V）進行等度洗脫，樣品運行時間3 min，色譜柱平衡時間2.1 min，檢測波長215 nm。

1.3.2.3 顏色

柑橘酒的顏色采用CIELab顏色空間進行評價[22,25-26]。柑橘酒樣品經過離心后用0.45 μm濾膜過濾，置于0.1 cm石英比色皿中，采用紫外-可見分光光度計連續掃描200～700 nm波長紫外-可見光譜段，掃描間隔為1 nm，蒸餾水為空白。根據光譜值找出450、520、570、630 nm波長處的4 個吸光度，根據公式（1）～（3）計算L*、a*、b*值[22]；然后再根據公式（4）～（6）計算出C*、H*和E*值[27]：

式中：X、Y、Z分別為根據國際光學委員會（CIE）推薦的公式計算出200～700 nm波長范圍內的紅、綠、黃三原色刺激值；X10、Y10、Z10分別為CIE推薦的標準白光的顏色三刺激值（X10=94.825；Y10=100；Z10=107.381）。

1.3.2.4 香氣成分

采用SBSE-GC-MS法對柑橘酒中的香氣成分進行測定[28]，香氣物質萃取方法略作修改。取20 mL柑橘酒到50 mL樣品瓶中，添加60 μL 2-辛醇（0.552 g/L）內標物和攪拌棒，密閉樣品瓶，置于磁力攪拌器上，室溫萃取1 h，然后進行GC-MS分析。

1.3.2.5 感官評價

柑橘酒感官量化分析采用文獻[29]的方法進行。品嘗小組由26 名葡萄酒專業的柑橘酒苦味品鑒成員構成，感官分析前用葡萄酒標準香氣物質和柑橘酒特征苦味物質進行嗅覺和味覺的訓練，直至特征香氣及苦味物質辨別分析結果偏差小于整體平均值的5%。要求用葡萄酒標準香氣的5～6 個特征詞匯描述樣品香氣特征，并用五點標度法對所有感官特征進行量化，通過使用頻率和強度均分的幾何平均數[29-32]表示香氣特征的量化強度（modified frequency，MF）值，計算如式（7）所示：

式中：F為某一特征打分值大于0的品嘗小組成員人數占總體品嘗小組成員的百分數/%；I為某一特征分值平均數占最大分值（5 分）的百分數/%。

1.4 數據分析

利用Excel和SPSS 18.0進行數據處理及統計分析，結果表示為 ±s。采用Origin 8.6.0進行繪圖。GC-MS分離得到香氣成分質譜數據經計算機檢索NIST library（11）、Wiley library（version 6.0）及香精香料標準譜庫進行定性。

定量：以2-辛醇為內標半定量。按式（8）、（9）計算：

2 結果與分析

2.1 發酵溫度對釀造柑橘酒品質指標的影響

表1 不同發酵溫度釀造柑橘酒的理化指標、顏色和“后苦”類物質Table 1 Physicochemical properties and DB substances of citrus wines fermented at different temperatures

在一定范圍內，溫度越高，酵母菌的發酵速率越快，到達發酵終點的時間就越短。由表1可知，不同發酵溫度，柑橘酒總浸出物差異顯著，14 ℃最低，30 ℃最高，可見溫度升高有利于總浸出物質量濃度增加，10 ℃時因為發酵時間較長，故總浸出物質量濃度較高；總酸差異顯著，14 ℃最低，18 ℃偏高，22 ℃最高；pH值在14、18、22 ℃和30 ℃較接近；多酚含量呈現降低趨勢，可見溫度越高越不利于多酚的生成和累積。柑橘酒樣品的各理化指標均符合GB 15037-2006《葡萄酒》要求。

由表1可知，不同發酵溫度釀造柑橘酒的明亮度L*值在95.00～96.84之間，酒體均具有良好的光澤，10 ℃顏色最亮，22 ℃顏色最暗；a*在-2.71～-2.14之間，酒體均有綠色傾向，22 ℃較其他酒樣更偏向于綠色；b*在14.52～24.09之間，酒體均偏向于黃色，22 ℃較其他酒樣更黃一些；C*在14.68～24.24之間，22 ℃較其他酒樣顏色最集中、色彩飽和度最高；色調角H*在-1.46°～-1.42°之間，所有酒樣均有稍微的藍色色調；E*在97.71～98.14之間，隨著溫度升高，E*呈現升高的趨勢，各酒樣之間具有一定的色彩差異。結合感官評定結果，隨著發酵溫度的升高，柑橘酒顏色呈現加深的趨勢，從淡黃色到禾稈黃，再到清淡琥珀色。

檸檬苦素的標準曲線方程為Y=2 583.6X+6 223.4（R2=0.996 4）；諾米林的標準曲線方程為Y=1 882.9X+1 554.6（R2=0.999 2）。由表1可知，不同發酵溫度釀造柑橘酒中“后苦”類物質只有檸檬苦素，而諾米林未檢出，隨著溫度升高，檸檬苦素含量呈現先降低后升高的趨勢，18 ℃含量最低，14 ℃次之，30 ℃最高。可能低溫和高溫均有利于“后苦”類物質的累積。

2.2 發酵溫度對柑橘酒香氣成分的影響

柑橘酒香氣主要來自于臍橙果實、酵母發酵及陳釀等過程。通過表2可知，不同發酵溫度釀造的柑橘酒中共鑒定出72 種香氣物質，包括酯類30 種、醇類3 種、萜烯類11 種、酸類6 種、醛酮類8 種和其他14 種，含量分別占檢出組分的41.67%、4.17%、15.28%、8.33%、11.11%和19.44%。

10、14、18、22、26 ℃和30 ℃發酵釀造柑橘酒中，香氣成分種類分別為36、42、47、44、45 種和48 種，香氣總量分別為5 027.49、10 632.86、10 754.75、7 901.29、7 220.96 mg/L和5 863.73 mg/L。隨著發酵溫度升高，香氣成分種類增加，總量先升高，18 ℃達到最大量后又逐漸降低。由此可見，適宜的發酵溫度有利于香氣成分種類及總量的增加。

2.2.1 酯類物質

醇和酸的酯化反應產生大部分的酯類香氣，給予柑橘酒新鮮的，類似蘋果、香蕉或菠蘿等的果香[38]和鮮花的芳香[39]，是貢獻較大的一類香氣物質[40]。據表2可知，不同發酵溫度釀造柑橘酒中酯類物質共檢測出30 種，隨著溫度升高，依次檢測出15、20、21、19、19 種和20 種，含量所占比例分別為47.27%、47.45%、45.68%、36.47%、35.65%、34.83%，呈現先升高后降低的趨勢。18 ℃酯類物質種類最多，其次是14 ℃；14 ℃酯類物質所占比例最大，其次是10 ℃和18 ℃。可見，適宜的發酵溫度會蓄積更多的酯類物質。

2.2.2 醇類物質

醇類物質主要來源于酵母的代謝、糖苷類香氣前體和酯的水解[41]，是柑橘酒的第2大類香氣物質。由表2可知，隨著發酵溫度的升高，醇類物質質量濃度分別為966.78、1 971.66、2 832.35、2 787.90、2 681.41 mg/L和2 346.10 mg/L，呈現先上升后下降的趨勢，與肖作兵等[42]的研究一致，18 ℃為最高，22 ℃次之，10 ℃最低；醇類物質含量所占比例分別為19.23%、18.54%、26.34%、35.28%、37.13%、40.01%，呈現先下降再上升的趨勢。適宜的發酵溫度有利于醇類物質的形成和累積。

適當高級醇總量（＜300 mg/L）可增加葡萄酒香氣的復雜性，而較高質量濃度（＞400 mg/L）則會賦予葡萄酒較重的化學味，破壞葡萄酒的感官品質[43]。結合柑橘酒感官評價結果發現這種破壞性在柑橘酒中并沒有顯現。

2.2.3 酸類物質

酸類物質本身就是香氣成分。揮發性酸主要來源于乙醇發酵[44]。由表2可知，隨著發酵溫度的升高，酸類物質所占比例分別為10.00%、23.64%、17.98%、14.57%、12.35%、9.02%，呈現先上升（14 ℃達到最大）后下降的趨勢；隨著發酵溫度升高，乙醇發酵呈現上升趨勢，當溫度超過酵母最佳繁殖溫度時，乙醇發酵便開始下降；再加上高溫會降低揮發酸的累積，比例呈現下降趨勢。

圖1 前2 個主成分上不同溫度釀造柑橘酒香氣化合物的載荷和溫度分布圖Fig. 1 Loadings plot of PC2 versus PC1 for aroma components of citrus wines fermented at different temperatures

2.2.4 醛酮類物質

醛酮類物質主要由酸的脫羧[45]和醇的氧化形成[46]。隨著發酵溫度的升高，醛酮類所占比例分別為20.20%、8.07%、8.18%、11.88%、12.96%、13.68%，呈現先下降再上升的趨勢。較低溫度較長時間的發酵，有利于醛酮類物質累積。2.2.5 其他

萜烯類所占比例為1.29%～2.83%，其他類為0.28%～1.01%，兩者總和所占比例為1.79%～3.30%，無明顯變化趨勢。

由表2可以看出，臍橙經不同發酵溫度釀造柑橘酒的香氣成分中，苯乙醇、里那醇、香葉基丙酮、金合

歡醇、反式-橙花叔醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、辛酸、月桂酸、棕櫚酸等25 種香氣成分是所有溫度共有的，質量濃度在1.26～2 351.55 mg/L，因發酵溫度的不同而有較大差異，它們可能構成臍橙釀造柑橘酒最基本的風味物質。另外，不同的發酵溫度均有其特有的香氣成分，10 ℃釀造柑橘酒中有2-甲基萘（2.98 mg/L）、1-棕櫚酸甲基丁基酯（1.26 mg/L）和丁酸香茅酯（1.56 mg/L）；14 ℃釀造柑橘酒中有4-乙烯基愈創木酚（84.08 mg/L）和辛酸丙酯（3.66 mg/L）；1 8 ℃釀造柑橘酒中有抗壞血酸二棕櫚酸酯（0.95 mg/L）、α-丁酸苯乙酯（0.77 mg/L）、乙酸庚酯（4.48 mg/L）和沉香螺醇（9.68 mg/L）；22 ℃釀造柑橘酒中只有乙酸橙花酯（9.60 mg/L）；26 ℃釀造柑橘酒中有愈創蘭油烴（1.38 mg/L）、4-叔丁氧基苯乙烯（5.15 mg/L）和亞油酸（32.31 mg/L）；30 ℃釀造柑橘酒中有6,10-二甲基十一碳-5,9-二烯-2-醇（2.25 mg/L）、D-香茅醇（13.03 mg/L）、環氧化蛇麻烯（1.79 mg/L）、十二烷二酸二乙酯（3 9.8 0 m g/L）、2-辛酮（4.40 mg/L）、(-)-異長葉烯-9-酮（76.72 mg/L）和1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氫-4a,8-二甲基-2-(2-丙烯基)-1-萘酚（3.41 mg/L）。這些物質含量均不高，特定溫度會產生特定香氣成分。正是因為這些揮發性成分及相互之間微妙的量比關系，才形成了不同發酵溫度釀造柑橘酒所特有的氣味。

表2 不同發酵溫度釀造柑橘酒的香氣成分Table 2 Aroma components of citrus wines fermented at different temperatures

續表2

如圖1所示，選擇氣味活性值大于1，對柑橘酒香氣貢獻[31]較大的29 種香氣成分進行主成分分析，提取出的前2 個主成分累計貢獻率占總變量的51.66%和23.38%，其中，橫坐標解釋51.66%的變量，縱坐標解釋23.38%的變量以橫坐標為基準，10、14 ℃和18 ℃明顯區別于其他3 個溫度。18 ℃的發酵條件位于第1象限，與其密切相關的揮發性物質有乙酸異戊酯、丁二酸二乙酯、辛酸甲酯、苯乙醇、異戊醇等13 種，這些物質主要賦予柑橘酒玫瑰和薔薇等花香，香蕉和葡萄等果香，甜香、醇香和苦杏仁味；14 ℃的發酵條件位于第4象限，與它相關的揮發性物質有乙酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、月桂酸乙酯、里那醇等11 種，香氣效果主要為玫瑰等花香，草莓、香蕉、麝香葡萄和酸水果等果香，和一定的甜香、茴香和蠟味；10 ℃位于第3象限內，與之相關的揮發性物質僅有β-紫羅蘭酮；22 ℃、26℃和30 ℃位于第2象限內，和這些溫度相關的揮發性物質有苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、2-辛酮和D-香茅醇。

2.5 發酵溫度對柑橘酒感官品鑒的影響

從圖1、表3和表4可知，14 ℃和18 ℃所釀柑橘酒在香氣特征和感官特征方面整體優于10、22、26 ℃和30 ℃所釀柑橘酒。18 ℃所釀柑橘酒具有良好的感官呈現和整體平衡性，優雅的果香和花香，較其他酒樣更具復雜性。

表3 不同發酵溫度釀造柑橘酒樣品的香氣特征MF值Table 3 MF of aroma characteristics of citrus wines fermented at different temperatures %

表4 不同發酵溫度釀造柑橘酒樣品的感官特征MF值Table 4 MF of sensory characteristics of citrus wines fermented at different temperatures %

3 結 論

本研究以四川渠縣產臍橙為原料，10、14、18、22、26 ℃和30 ℃進行控溫發酵，對所釀柑橘酒的基本理化和感官指標進行對比研究。結果表明：發酵溫度對柑橘酒理化指標有一定的影響，隨著發酵溫度的升高，總浸出物質量濃度增加，多酚含量降低，總酸和還原糖差異顯著，乙醇體積分數、pH值差異不明顯；酒體顏色逐漸加深，從淡黃色到禾稈黃，再到清淡琥珀色。14 ℃呈現誘人的禾稈黃色，18 ℃顏色稍深；“后苦”類物質只有檸檬苦素檢出，含量呈現先降低后升高趨勢，18 ℃含量最低，14 ℃次之，可能低溫和高溫均有利于“后苦”類物質穩定的存在。隨著發酵溫度的升高，香氣成分種類增加，總量呈現先升高，18 ℃達到最大量后又逐漸降低。18 ℃所釀柑橘酒，酯類、醇類等優質香氣成分種類及含量均最高且結構合理，呈現柑橘酒所特有的柚子、蘋果、水蜜桃、菠蘿等果香，茉莉等香甜的花香，輕微的苦杏仁及青椒的香氣。主成分分析和感官評定結果表明：發酵溫度與香氣物質之間存在著一定的相關性，不同的釀造溫度會產生該溫度下柑橘酒所特有的香氣成分，故14 ℃和18 ℃所釀柑橘酒整體較優，18 ℃所釀柑橘酒更具復雜性。