基于氣相色譜-質譜聯用與偏最小二乘-判別分析的啤酒爽口性評價

陳華磊，楊朝霞，王成紅，閆 鵬，張宇昕，李 梅

（青島啤酒股份有限公司 啤酒生物發酵工程國家重點實驗室，山東 青島 266100）

爽口性是啤酒口感的重要評價指標之一，也是啤酒中多種化合物相互共同作用的結果。Martina等[1]將啤酒口感歸入除化學刺激（包括嗅覺與味覺）外由物理化學多因素作用引起的機械刺激。Alex[2]也將口感列為觸覺感受。它不像啤酒風味中的嗅覺與味覺的研究，可采取外添加標準物質的方法來確定感官感受與風味物質之間的對應性，從而明確關鍵風味化合物，并進一步進行發酵過程變化規律及相關機理與風味調控的研究。由于啤酒口感受到多方面因素影響，其物理化學交互作用顯著，因此上述研究方法并不適用。Miyashita等[3]將啤酒口感中的順滑、脆爽、干凈、回味等感官感受整合為爽口性的概念，通過專用氣相色譜儀分析上百種風味物質并與品評結合，通過偏最小二乘判別分析（partial least squaresdiscrimination analysis，PLS-DA）法建立數學模型，對未知啤酒樣品的爽口性進行預測。在此過程中選擇7 種重要變量（VIP＞1）：辛酸、辛酸乙酯、癸酸、癸酸乙酯、異戊醇、香葉烯、乙酸苯乙酯，其中除異戊醇外其余指標均與爽口性呈負相關。

頂空固相微萃取（h e a d s p a c e s o l i d-p h a s e microextraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術是目前研究食品風味的重要手段，廣泛應用于葡萄酒[4-6]、啤酒[7-10]及白酒[11-13]等酒精飲料中風味物質的定性定量研究，并在質量控制及食品安全方面也起到了重要作用[14]。PLS-DA基于PLS回歸方法，具有簡單高效的特點，已經被廣泛應用[15-24]。

本研究利用HS-SPME-GC-MS技術檢測啤酒中7 種有爽口性相關的關鍵風味物質，與品評結果一同轉化為數學矩陣，并利用PLS-DA方法對其進行建模分析，建立一種快速簡便的啤酒爽口性判定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同生產商及生產日期的77 份Lager啤酒樣品 市購。

標準品（純度）：辛酸（≥98%）、辛酸乙酯（≥98%）、癸酸（≥98%）、癸酸乙酯（≥98%）、異戊醇（≥99%）、香葉烯（≥98%）、乙酸異戊酯（≥98%） 美國Sigma-Aldrich公司；乙醇（分析純）天津恒興化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

S Q 8 C GC-M S聯用儀、D B-5M S毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.50 μm） 美國Perkin Elmer公司；PAL COMBI-xt自動進樣器 瑞士CTC公司；65 μm聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯涂層纖維、20 mL帶PTFE涂層硅橡膠墊的頂空瓶 美國Sigma-Aldrich公司；Milli-Q純水器 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制及校準曲線的制定

分別將25 mg標準品溶于25 mL 5%乙醇溶液中，配制成質量濃度為1 000 mg/L的標準溶液，用于校準曲線的制定。

1.3.2 HS-SPME樣品制備

取5 mL排氣啤酒樣品置于20 mL頂空瓶中，旋緊瓶蓋，然后將樣品瓶置于自動進樣器托盤中。分析時SPME纖維插入樣品瓶的頂空部分，在250 r/min振動速率條件下50 ℃萃取40 min，再將纖維插入GC進樣口，250 ℃解吸5 min，此過程在自動進樣器上自動完成。

1.3.3 GC-MS測試條件

GC條件：DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.50 μm）；載氣為氦氣，流速1.3 mL/min；進樣口溫度250 ℃，不分流進樣；程序升溫：40 ℃保持2 min，以3 ℃/min升溫，250 ℃保持1 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；GC-MS接口溫度250 ℃；離子源溫度200 ℃；質量掃描范圍29～500 u。被測組分定性采用全掃描模式，NIST 2014標準譜庫檢索。定量采用選擇離子監控模式。

1.3.4 感官品評

選取8 位有經驗的啤酒品評專家組成品評小組，參照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[25]將樣品置于12 ℃恒溫水浴中，并對77 例啤酒樣品進行感官品評。將品評結果分為4 類：爽口性最差的啤酒為1 分，爽口性最佳的啤酒為4 分，并與GC-MS檢測數據進行歸一化處理，得到相關化學信息的關系矩陣。

1.4 數據處理

本研究對某啤酒生產企業于2017年在國內11 個不同生產廠生產的不同原麥汁濃度的啤酒進行取樣，共77 例樣品按爽口性品評結果分為4 類，GC-MS檢測數據為自變量，將這些數據導入SIMCA-P 14.1進行PLSDA。數據分析采用軟件MS Workstation 8.0、Microsoft Excel、SIMCA-P 14.1。分析方法過程如下：建立訓練集樣本分類變量；對分類變量和數據進行PLS-DA，建立類別判別回歸模型；根據所建立模型計算測試集的分類變量值Yp，Yp＞0.5、偏差＜0.5，判定屬于該類；Yp＜0.5、偏差＜0.5，判定不屬于該類；偏差≥0.5，判別不穩定。

2 結果與分析

在收集的77 例樣本中隨機選取其中50 例為訓練集，其余27 例為測試集。現將50 例樣本作為訓練集導入SIMCA-P 14.1軟件進行PLS-DA，如表1、2所示。

表1 校準集樣品信息Table 1 Information about the calibration set of samples

表2 測試集樣品信息Table 2 Information about the test set of samples

2.1 模型選擇

圖1 主成分分析得分圖（A）和PLS-DA得分圖（B）Fig. 1 Score plots of principal component analysis (A) and PLS-DA (B)

在PLS-DA前先進行主成分分析，如圖1A所示，前3 個主成分對應特征值累計貢獻率為77.9%，可表征相關風味成分的大部分信息。從圖1A可直觀判斷不同樣品組間區分還不夠明顯，存在重疊現象；但多數樣本在95%的置信區間內，說明搜集的樣本本身質量穩定、分布均勻、模型穩健，且實驗操作過程也沒有引入較大誤差。因此，這些數據可用于進一步的PSL-DA。如圖1B所示，由于同時使用了X變量與Class分組變量，因此使組間差異明顯改善，較主成分分析能夠更好區分不同組間的樣本。

2.2 模型建立

由于PLS-DA通過對變量空間的投影旋轉找出類別判別的潛在變量，可有效避免主成分分析中代表樣本類別的方向與方差最大方向不一致的情況。按照樣本類別特征賦予訓練集樣本分類變量值。本研究根據實際品評結果，人工設置樣本分類變量組，然后利用PLS-DA回歸分析方法對訓練集樣本的7 種爽口性關鍵風味組分與品評得分進行回歸分析，并建立PLS-DA回歸模型。

將50 個樣本按品評結果分為4 組數據集作為建模的訓練集，其PLS-DA回歸曲線圖的相關系數分別為0.861、0.798、0.765、0.812，樣品辨別率為92%，說明模型的擬合較好，具有較高的可靠性，可用于判別未知啤酒樣品的爽口性。

圖2 PLS-DA載荷圖Fig. 2 Loading plot of PLS-DA

如圖2所示，DA（1）、DA（2）、DA（3）、DA（4）分別表示4 組類別變量Y在載荷圖中的位置，Y附近的X變量對此類別有更高的辨別能力。圖中顯示辛酸乙酯、癸酸乙酯及乙酸異戊酯等酯類化合物為DA（1）與DA（2）的特征敏感特征變量；而DA（3）的敏感特征變量為辛酸、癸酸與香葉烯。

2.3 模型驗證

SIMCA-P采用置換檢驗對PLS-DA模型進行驗證。利用樣本數據的隨機排列進行統計推斷[26]。它通過對樣本進行順序上的置換，重新計算統計檢驗量，構造經驗分布，然后在此基礎上求出P值進行推斷。Y的順序被隨機地重復200 次，并且分離的模型被擬合到所有置換的Y中，提取與原始矩陣Y一樣多的分量。

圖3 PLS-DA模型置換驗證圖Fig. 3 Permutation validation of the PLS-DA model

Q2為累計交叉有效性，其值越大表示模型的預測能力越好；R2為累計方差值，表示有多少原始數據被用來建立新的PLS-DA判別模型，其值大則表示模型的解釋能力強。由圖3可以看出，左側的R2和Q2值均低于最右邊的R2和Q2值，且Q2回歸線的截距均為負值，說明所構建的4 個PLS-DA判別模型均沒有出現過擬合的現象，且都有較好預測能力，都能用于各自類別的判別分析。

2.4 模型預測

27 個樣本作為驗證集，使用已建立的PLS-DA模型進行判別。如表3所示，不同啤酒樣品的爽口性預測均方根誤差在0.183～0.523之間，未知樣品的預測識別率為74.07%，說明所建立的PLS-DA模型能很好地預測和評價未知樣品爽口性。

表3 PLS-DA判別模型分析結果Table 3 Analysis results with the PLS-DA model

3 結 論

目前PLS-DA建模方法非常成熟，已應用到啤酒分析的各個方面[27]，其方法簡單、快捷，解釋能力強。本研究采用HS-SPME-GC-MS技術結合PLS-DA建立相應的數學模型并對啤酒爽口性進行判別，其結果能夠很好地判別啤酒爽口性的程度。通過外部測試集驗證，該模型具有較強的預測能力，校正集均方根誤差與預測均方根誤差參數均具有較好的預測精度，可滿足判斷不同啤酒樣品爽口性的需求。

由于影響啤酒口感的因素眾多，除本實驗涉及的幾種風味物質外，成品酒中的離子及蛋白[28]的組成，丙三醇、殘糖[29]和苦味物質[30]的含量分布及飲用時的酒體溫度[31]等因素均會不同程度地影響啤酒爽口性，因此要更加準確地判別啤酒爽口性，進一步提高模型的準確性及精度，還需在更大范圍內建立相應的數學模型。