郫縣豆瓣醬風味成分的全二維氣相色譜-飛行時間質譜分析

李偉麗，袁 旭，劉玉淑，伍小宇，唐 勇，林洪斌,2，劉 平，丁文武，車振明，吳 韜,*

（1.西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039；2.四川大學輕紡與食品學院，四川 成都 610065）

郫縣豆瓣醬俗稱郫縣豆瓣，距今已有300多年的歷史。它以二荊條紅辣椒、青皮蠶豆、小麥粉為主要原料，通過微生物制曲、前發酵，再經過翻、曬、露等后發酵工藝釀制而成[1-2]，其制作技藝已經列入國家級非物質文化遺產名錄[3]。郫縣豆瓣具有色澤紅褐油潤、瓣粒香脆、味鮮辣及醬酯香等特點，是川菜食譜中最經典的調味品之一，被譽為“川菜之魂”。

由于郫縣豆瓣風味獨特，對其風味成分的研究受到學者們廣泛關注。例如羅靜等[4]采用氣相色譜-質譜法測定不同后發酵期郫縣豆瓣樣品中揮發性呈香物質，共檢測出9 個類別超過140 種揮發性呈香物質。劉平等[5]采用氣相色譜-嗅覺測量法及香氣活性值法對郫縣豆瓣中的特征香氣物質進行鑒定，共檢測出112 種揮發性物質。隨著研究的不斷深入，傳統的氣相色譜及氣相色譜-質譜法在風味成分研究上的局限性也逐漸暴露出來，主要存在分離度低、峰容量有限、檢測成分較少等缺陷。全二維氣相色譜-飛行時間質譜（comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOF MS）是將兩根不同極性固定相的色譜柱以串聯方式連接在一起，進行正交分離。所檢測的成分首先通過第1維色譜柱分離后，經調制器聚焦，然后以脈沖方式進入第2維色譜柱進行二次分離[6-8]。因而GC×GC-TOF MS具有高分離度、高分辨率、高靈敏度和高峰容量等優點，對食品復雜組分分離鑒定具有顯著的優勢。目前GC×GC-TOF MS已成功應用于茶[9-10]、香醋[11-12]、白酒[13-14]、豆醬[15]等發酵食品研究。前人對于郫縣豆瓣的風味成分研究集中在酯類、醇類等揮發性香氣成分，對于非揮發性成分研究尚鮮見報道。因而，本研究擬采用柱前衍生化法，結合GC×GC-TOF MS技術鑒定郫縣豆瓣的風味物質，為闡明其風味物質基礎、質量標準提升及工藝優化等提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3 批不同特級豆瓣醬樣品購買于四川省成都市郫都區超市，生產日期分別為2016年5月、2016年8月和2016年12月。豆瓣醬經冷凍干燥后，粉碎過100 目篩，備用。

異丙醇、乙腈（均為色譜純） 德國C N W Technologies公司；吡啶（色譜純） 上海Adamas公司；甲氧銨鹽（分析純） 日本TCI公司；核糖醇（純度≥99%） 美國Sigma公司；衍生化試劑：雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（含有1%三甲基氯硅烷） 美國REGIS Technologies公司。

1.2 儀器與設備

手動75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco科技公司；GC×GC-TOF MS系統、7890B GC儀、DB-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm）色譜柱、DB-17HT（1.9 m×100 μm，0.1 μm）色譜柱 美國安捷倫科技公司；PEGASUS 4D TOF MS 美國力可公司；Heraeus Fresco17型離心機、Forma 900 series型超低溫冰箱美國Thermo Fisher Scientific公司；BSA124S-CW型分析天平 德國Sartorius公司；JXFSTPRP-24型研磨儀上海凈信科技有限公司；TNG-T98型真空干燥儀 太倉市華美生化儀器廠；PS-60AL型超聲儀 深圳市雷德邦電子有限公司；DHG-9023A型烘箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 液液萃取方法提取

參照Kind等[16]的方法稍作修改。準確稱取粉末樣品100 mg于2 mL EP管中，加入1 mL提取液（異丙醇-乙腈-超純水體積比3∶2∶2），再加入20 μL核糖醇，渦旋30 s。加入磁珠，45 Hz研磨儀處理4 min，超聲10 min（冰水?。缓? ℃、12 000 r/min離心8 min。移取0.8 mL上清液于2 mL進樣瓶（甲烷硅基化）中，在真空濃縮器中干燥提取物，然后向干燥后的代謝物中加入200 μL甲氧銨鹽試劑（甲氧銨鹽酸鹽溶于吡啶，20 mg/mL），輕輕混勻后，放入烘箱中50 ℃孵育90 min。最后向樣品中加入200 μL雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（含有1%三甲基氯硅烷），將混合物50 ℃孵育30 min，然后上機檢測。所有樣品均重復3 次。

1.3.2 GC條件

柱系統由兩根色譜柱組成：柱1：DB-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm），柱2：DB-17HT（1.9 m×100 μm，0.1 μm），柱子之間通過毛細管柱連接器連接。載氣為氦氣，流速1.0 mL/min。操作條件：升溫程序從90 ℃開始，保持1 min，以5 ℃/min速率升到170 ℃，再以10 ℃/min速率升到250 ℃，最后以25 ℃/min速率升到300 ℃，保留13 min。進樣口采用分流模式，進樣量為1.0 μL，隔墊吹掃流速為3 mL/min。

1.3.3 MS條件

采用電子電離源，電子轟擊能量為-70 eV；前進樣口溫度為270 ℃，傳輸線溫度為300 ℃，離子源溫度為220 ℃；質量掃描范圍m/z為33～600，掃描速率為100 spectrum/s，溶劑延遲為0.3 min。

1.4 數據處理

數據處理使用ChromaTOF軟件對質譜數據進行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析。

2 結果與分析

2.1 郫縣豆瓣成分的GC×GC-TOF MS分析

郫縣豆瓣風味成分十分復雜，樣品需要預處理才能檢測。目前前處理方法包括固相微萃取方法和液液萃取方法。其中采用固相微萃取方法檢測郫縣豆瓣中的揮發性香氣成分已有較多文獻報道。例如黃著等[17]采用固相微萃取方法提取郫縣豆瓣醬的揮發性組分，經GC-MS分離鑒定出8 類共計82 種化合物；黃湛等[18]通過頂空固相微萃取方法測定7 個不同后發酵期郫縣豆瓣樣品，共檢測出104 種揮發性風味物質；劉燕等[19]采用固相微萃取方法從干燥的郫縣豆瓣樣品中鑒定出44 種揮發性物質；Li Xiyang等[20]采用固相微萃取方法從傳統郫縣豆瓣和商業郫縣豆瓣樣品中分別鑒定出56 種和37 種風味物質。為更好地提取郫縣豆瓣中的風味成分，本研究首先對比固相微萃取方法與液液萃取方法提取效率。固相微萃取方法能檢測到856 個化合物，而液液萃取法可以檢測到987 個化合物，因而，本研究采用液液萃取法提取樣品。這與前人研究結果類似，例如Yao Feng等[21]以白酒為研究對象，采用固相微萃取方法鑒定得到2 178 種成分，而液液萃取方法鑒定得到2 482 種成分，表明液液萃取方法能夠獲得更多的風味成分。

在分離過程中，第1維柱子采用非極性柱（DB-5MS）分離，第2維柱子采用中等極性柱（DB-17HT）進行正交分離。從圖1可以看出，郫縣豆瓣組分極為復雜，其一維色譜圖中有大量化合物存在共流出現象，通過進一步的二維色譜分離，共流出的化合物在二維色譜圖中得到較好分離，有利于進一步對這些化合物進行準確定性及定量分析。本研究在特級郫縣豆瓣醬樣品中共分離檢測到1 005 個化合物，遠高于以往研究報道。

圖1 特級郫縣豆瓣醬的3D色譜圖Fig. 1 3D chromatogram of volatile fl avor compounds in special grade Pixian bean paste

2.2 定性分類

本研究首先通過Pegasus 4D色譜分析工作站，結合Mainlib譜庫、Replib譜庫、NIST譜庫以及Wiley譜庫的自動解卷積和檢索分析（選擇RSN＞50的色譜峰進行分析），選擇相似度大于800。從豆瓣醬樣品中鑒定出218 種物質，可將鑒定出的物質分為10 類，如圖2所示，分別為有機酸類、氨基酸類及其衍生物、糖類及其衍生物、醇類、胺類、酯類、酮類、酚類及其他化合物（主要包括含硫化合物、氮雜環化合物和氧雜環化合物）。由圖2可知，有機酸類化合物種類最多，達到72 種，其次為氨基酸及其衍生物，為40 種。醛類化合物和酚類化合物少，分別為5 種和4 種。

圖2 特級郫縣豆瓣醬中物質種類分布Fig. 2 Various classes of volatile components identified in special grade Pixian bean paste

圖3 郫縣豆瓣醬中物質的相對含量Fig. 3 Relative contents of various classes of volatile compounds identified in special grade Pixian bean paste

如圖3所示，有機酸類化合物在郫縣豆瓣醬物質基礎中的相對含量最高，占比為30.36%。其次為氨基酸及其衍生物和胺類化合物，分別為26.58%和16.48%。而酮類化合物、醛類化合物和酚類化合物在郫縣豆瓣中的相對含量較少，均小于1.0%。以往郫縣豆瓣揮發性成分檢測結果，主要成分是醇和酯[17-20]。本研究通過衍生化技術增強了一些難以揮發成分的檢測，因此能夠測定到更多的風味成分。例如有機酸、糖類和氨基酸類等成分檢測。結合圖2和圖3可知，在特級郫縣豆瓣樣品中，有機酸類化合物和氨基酸及其衍生物的種類和相對含量均較高，而糖類及其衍生物的種類較多但相對含量卻較少，造成此現象的原因可能是特級豆瓣醬的發酵時間長，在其發酵過程中，由于蛋白酶的作用，蛋白質水解產生游離氨基酸，美拉德反應和Strecker氨基酸降解反應又會消耗所產生的游離氨基酸，同時氨基酸還可以通過脫氨作用、轉氨作用、聯合脫氨或脫羧作用，分解成胺類、α-酮酸等物質，這些物質可以轉變成糖、脂類或再合成某些非必需氨基酸[22-23]。而糖類化合物作為微生物發酵過程的碳源和能源，不斷被微生物消耗產生酸，因此糖類含量較低[24-25]。

2.3 定量分析

如表2所示，有機酸類化合物是特級郫縣豆瓣醬中含量最高的一類化合物，其中戊二酸和肌酸是含量最高的2 種有機酸，相對含量分別達到14.72%和6.65%。醇類化合物中D(+)-阿拉伯糖醇（1.37%）、山梨糖醇（3.11%）和肌醇（1.15%）等物質的相對含量較高。15 種胺類化合物中乙酰苯胺（11.58%）和丙二酰胺（3.23%）為主要組成物質。22 種糖類及其衍生物中，塔格糖、果糖、麥芽三糖和D-半乳糖含量相對較高。酯類化合物主要物質為十七酸甲酯（2.20%）和1-甘油-棕櫚酸酯（0.50%），其余物質相對含量均較低（＜0.1%）。4 種酚類化合物、9 種酮類化合物和5 種醛類化合物的相對含量均較低（＜0.1%）。以往報道中豆瓣醬除醇類、酯類、酸類等揮發性成分外[26]，氨基酸則是豆瓣醬的主要呈味物質[27]，其中天冬氨酸和谷氨酸為鮮味氨基酸，是豆瓣醬中鮮味的主要來源[28]。然而，本實驗中天冬氨酸相對含量很低（＜0.01%，未列出），谷氨酸相對含量為4.04%。其可能原因在于樣品成分不完全一樣，其中丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甘氨酸為甜味氨基酸[29-30]，對豆瓣醬的風味形成有利，在特級郫縣豆瓣醬中的相對含量分別為2.38%、0.67%、0.50%和1.06%。

表2 郫縣豆瓣醬GC×GC-TOF MS分析鑒定出的主要物質Table 2 List of main components indenti fi ed in special grade Pixian bean paste by GC ×GC-TOF MS analysis

續表2

3 結 論

本研究通過柱前衍生化技術，增強一些難以揮發成分的檢測，因此能夠檢測到更多的成分。進一步采用GC×GC-TOF MS技術，實現對郫縣豆瓣復雜風味成分的分離分析。定性鑒定出包括有機酸類、氨基酸及其衍生物、糖類及其衍生物、醇類、酯類、酚類、酮類、醛類、胺類及其他類化合物（主要包括含硫化合物、氮雜環化合物和氧雜環化合物）在內的10 類物質共218 種成分。研究結果為郫縣豆瓣風味解析、工藝優化及質量標準提升等提供科學依據。