昆布多糖不同提取工藝優化及其理化性質和抗腫瘤活性比較

李 瑩，黃德春，陳貴堂*，艾宗華，蔣思琪，康譯心，高仕婧

（中國藥科大學工學院，江蘇 南京 211198）

近年來，對多糖的研究一直是個熱點，并且主要集中在提取和活性分析方面。目前多糖的提取方法主要有溶劑提取法（熱水浸提[1]、堿液提取[2]、酸液提取[3]等）、輔助提取法（微波輔助提取[4]、超聲輔助提取[5]、高壓輔助提取[6]、酶輔助提取[7]等）以及聯合提取法[8]等。研究表明，不同的提取方法不但影響多糖的提取效率，而且影響多糖的分子質量、單糖組成、結構以及生物活性[9-10]。如Zhu Zhenyuan等[11]比較了冷水、熱水、超聲、微波、纖維素酶5 種提取方法對古尼蟲草多糖的影響，結果表明，微波提取多糖提取率和抗腫瘤活性均最高；Wang Junlong等[12]研究發現，微波輔助提取過程中白沙蒿多糖的分子發生了降解，但微波輔助提取法提取的多糖比熱水提取法具有較高的抗氧化活性；Zhao Chengcheng等[13]比較了冷水、溫水、熱水、超聲輔助提取4 種提取方法對黏山藥多糖特征和生物活性的影響，發現熱水提取多糖提取率最高、分子質量最大，冷水提取多糖分子質量最小、糖醛酸含量高、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性和降血糖活性較高，而超聲輔助提取多糖分子質量較小、亞鐵還原力最強；而Yan Yajuan等[14]在比較熱水、微波、超聲、酶4 種不同方法提取砂仁多糖的研究中發現，超聲提取多糖提取率、糖醛酸和硫酸基含量均最高，其抗氧化活性也最強。由此可見，在多糖提取中，不同提取方法對同種原料產生效果不同，而同種方法對不同原料產生的效果也不同，沒有規律可循。

昆布是褐藻門海帶目海帶科植物海帶（Laminaria japonicaAresch）或翅藻科植物昆布（Ecklonia kuromeOkam）的干燥葉狀體[15]，其不僅營養豐富，味道鮮美，而且具有較高的藥用價值，是藥食兩用物質之一。現代研究表明，昆布含有藻膠酸、氨基酸、多糖、甘露醇等多種有效成分以及豐富的碘，其中昆布多糖是昆布的主要活性成分之一，與昆布的許多生理效應有關，如抗糖尿病[16]、調節血脂[17-18]、抗菌[19]、提高機體免疫、抗腫瘤[20-21]等作用。目前已有的文獻中，雖然對昆布多糖提取方法和生物活性的研究較多，但鮮見全面地比較不同提取方法對昆布多糖的性質和生物活性影響方面的報道。因此，本實驗采用熱水浸提、超聲輔助提取以及復合酶提取3 種方法提取昆布多糖，并對其理化性質和抗腫瘤活性進行比較分析，以期為進一步探明不同提取方法與多糖結構和抗腫瘤活性的關系，尋求適合昆布多糖的最佳提取工藝，為昆布多糖的深入開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆布購自南京鹿江中藥飲片廠，經粉碎后過60 目篩備用。

纖維素酶（1 800 U/mg）、果膠酶（1 000 U/mg）上海金穗生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（3 U/mg）阿拉丁試劑（上海）有限公司；小牛血清 美國Gibco公司；DMEM/F12（1∶1）培養液 美國HyClone公司；噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 江蘇凱基生物技術股份有限公司；剛果紅、鹽酸阿霉素（doxorubicin hydrochloride，DOX） 北京博奧拓達科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DFY-500搖擺式高速中藥粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；TU-1901紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；LXJ-IIB離心機 上海安亭科學儀器廠；JY-92IIN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SHJ-4水浴恒溫磁力攪拌器 常州亞特實驗儀器有限公司；PD-1C-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；ATX224分析天平 日本島津儀器公司；RE-5205旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；Elx800TM酶標儀 美國BioTek公司；CO2生化培養箱 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 熱水浸提法提取昆布多糖工藝優化

稱取一定量昆布粉，固定反應條件料液比1∶60（g/mL）、提取時間2 h、考察不同提取溫度（25、35、45、55、65、75、85 ℃）對昆布多糖提取率的影響；固定反應條件料液比1∶60（g/mL）、提取溫度80 ℃，考察不同提取時間（1、2、3、4、5、6 h）對昆布多糖提取率的影響；固定反應條件提取時間2 h、提取溫度80 ℃，考察不同料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g/mL））對昆布多糖提取率的影響。

在單因素試驗的基礎上，選取3 個單因素試驗中測得的最佳條件正交試驗，以多糖的提取率為指標，優化提取工藝參數。

1.3.2 超聲輔助提取法提取昆布多糖工藝優化

稱取一定量昆布粉，固定反應條件料液比1∶60（g/mL）、超聲時間5 min，考察超聲功率（100、200、300、400、500 W）對昆布多糖提取率的影響；固定反應條件料液比1∶60（g/mL）、超聲功率200 W，考察不同超聲時間（2、4、6、8、10、12 min）對昆布多糖提取率的影響；固定反應條件超聲功率200 W、超聲時間5 min，考察料液比（1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100（g/mL））對昆布多糖提取率的影響。

在單因素試驗的基礎上，選取3 個單因素試驗中測得的最佳條件進行正交試驗，以多糖的提取率為指標，優化提取工藝參數。

1.3.3 復合酶法提取昆布多糖工藝優化

稱取一定量昆布粉，固定反應條件pH 5、水浴提取溫度50 ℃、水浴提取時間3 h、料液比1∶70（g/mL）、木瓜蛋白酶30 U/g、果膠酶10 000 U/g，考察不同纖維素酶用量（18 000、36 000、54 000、72 000、90 000、108 000、126 000 U/g）對昆布多糖提取率的影響；固定反應條件pH 5、水浴提取溫度50 ℃、水浴提取時間3 h、料液比1∶70（g/mL），木瓜蛋白酶30 U/g、纖維素酶18 000 U/g，考察不同果膠酶用量（5 000、10 000、15 000、20 000、25 000、30 000 U/g）對昆布多糖提取率的影響；固定反應條件pH 5、水浴提取溫度50 ℃、水浴提取時間3 h、料液比1∶70（g/mL）、果膠酶10 000 U/g、纖維素酶18 000 U/g，100 ℃滅酶10 min，考察不同木瓜蛋白酶用量（45、60、75、90、105 U/g）對昆布多糖提取率的影響。

在單因素試驗的基礎上，選取3 個單因素試驗測得的最佳條件進行正交試驗，以多糖提取率為指標，優化提取工藝參數。

1.3.4 粗多糖干品的制備

根據正交試驗最優提取條件進行多糖提取，4 000 r/min離心20 min，得到上清液，用Sevag法[22]除去蛋白質后，用無水乙醇進行沉淀，然后用乙醇、丙酮洗滌，真空干燥，分別得到3 種昆布粗多糖干品。

1.3.5 多糖溶解性測定

昆布多糖（0.1 g）置于150 mL燒杯內，加入100 mL蒸餾水使之在不同溫度（20、40、60、80、100 ℃）條件下水浴溶解，用磁力攪拌，記錄從開始到昆布粗多糖完全溶解所需時間[23]。

1.3.6 剛果紅實驗

稱取4 mg多糖樣品，加入2 mL蒸餾水和2 mL剛果紅試劑（80 μg/mL），加入1 mol/L的NaOH溶液，調節NaOH溶液終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L和0.5 mol/L，紫外分光光度計掃描，測得不同濃度條件下溶液的最大吸收波長。與剛果紅對比，判斷昆布多糖是否具有三股螺旋結構[24]。

1.3.7 紫外光譜特征

配制200 μg/mL的昆布多糖溶液，以蒸餾水為空白，利用紫外分光光度計在波長190～400 nm范圍內測定吸光度，間隔1 nm，繪制昆布多糖紫外光譜特征曲線，判斷所提取的昆布多糖中是否含有蛋白質和核酸。

1.3.8 MTT法測定腫瘤細胞的抑制率

將處于對數期的MCF-7和A549細胞用胰酶消化后配制成濃度為1×104個/mL的細胞懸液，每孔100 μL加入到96 孔板內。次日加入含有DOX或不同藥物濃度和相應溶劑對照的新鮮培養基，每孔加100 μL。每種藥物設4 個劑量組，即DOX（1、0.8、0.6、0.4 μg/mL），多糖組（560、420、280、140 μg/mL），每組6 個平行孔，給藥后在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱內培養72 h。培養結束后每孔加10 μL新鮮配制的5 mg/mL MTT溶液，繼續培養4 h，棄去上清液，每孔加入200 μL二甲基亞砜溶解沉淀，恒溫振蕩培養箱搖勻，用酶標儀在波長570 nm處測定吸光度，計算樣品的腫瘤細胞抑制率，并由SPSS 22.0軟件計算半抑制濃度（the half maximal inhibitory concentration，IC50）[25]。

1.4 數據處理

實驗數據以 ±s表示，采用SPSS 22軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 熱水浸提法提取昆布多糖

2.1.1 單因素試驗結果

圖1 提取溫度（A）、提取時間（B）和料液比（C）對昆布多糖提取率的影響Fig. 1 Effects of temperature (A), extraction time (B) and solid-tosolvent ratio (C) on the extraction efficiency of polysaccharides by HWE

從圖1A可以看出，隨著提取溫度的逐漸升高，溶液中的昆布多糖提取率先緩慢增長，在高于45 ℃時，有一個較快增長，在75 ℃時達到極值，隨后不再增長。因此，在本實驗條件下，昆布多糖的最適提取溫度為75 ℃。從圖1B可以看出，隨著提取時間的延長，昆布多糖提取率逐漸升高，在4 h時達到極值，后趨于平緩。因此選擇4 h為最佳提取時間。由圖1C可知，隨著料液比的增加，昆布多糖提取率一直呈現上升趨勢，直到在料液比1∶70（g/mL）時達到極值，之后趨于平緩，因此選擇料液比1∶70為最佳提取條件。

2.1.2 正交試驗結果

表1 熱水浸提法L9（33）正交試驗設計與結果Table 1 Orthogonal array design L9 (33) with experimental results for optimization of HWE conditions

如表1所示，影響昆布多糖提取率的最主因素是提取溫度，主次因素依次為A＞B＞C，最優水平組合為A3B3C3，即提取溫度85 ℃、料液比1∶80（g/mL）、提取時間5 h。對最優試驗條件進行3 組平行實驗驗證，在最優條件下，昆布多糖提取率為（5.97±0.04）%。可見，該正交試驗結果可靠。

熱水浸提是提取多糖的傳統方法，其提取效果主要受提取溫度、提取時間以及料液比等因素等影響。本實驗結果符合文獻報道的一般結論。如魏曉梅等[26]在云南松茸多糖提取方案優化及測定中，得到最佳水提條件為溫度80 ℃、時間3 h、料液比1∶15（g/mL）；朱振元等[27]的滑子菇多糖提取工藝優化中，得到最佳提取條件為溫度85 ℃、提取2 h、料液比1∶40（g/mL）。可見，多糖多在溫度較高時容易提取出來，不同原料的提取最優料液比與時間有差別，這與不同原料自身的性質有關。

2.2 超聲輔助提取法提取昆布多糖

2.2.1 單因素試驗結果

圖2 超聲功率（A）、超聲時間（B）和料液比（C）對昆布多糖提取率的影響Fig. 2 Effects of ultrasonic power (A), irradiation time (B) and solid-tosolvent ratio (C) on the extraction efficiency of polysaccharides by UAE

由圖2A可知，從100 W開始，隨著超聲功率的增加，昆布多糖提取率快速增加，但在超聲功率為400 W時達到最高點，之后開始下降。超聲功率的增加使得同樣時間內對細胞壁的作用增強，多糖分子可以更順利的從細胞內進入到溶液中，從而在一定范圍內，昆布多糖提取率一直在增加，但當達到最高點后，過大的超聲功率可能會對多糖分子產生破壞作用，使多糖提取率下降。從圖2B可以看出，隨著超聲時間的延長，昆布多糖提取率幾乎以直線形式增加，但在第10分鐘時達到最高點，之后開始下降。這可能由于隨著超聲時間的延長，多糖以至單糖的結構發生了變化，化學鍵如C—O—C和C—O—H鍵斷裂導致不能發生顯色反應，從而造成苯酚-硫酸法測定的總糖含量降低[28-29]。從圖2C可以看出，隨著料液比的增大，昆布多糖提取率逐漸增多，在料液比為1∶80（g/mL）時達到最高點，然后趨于平緩。可見料液比越大，可容納的多糖分子越多，但并不能無限增多，溶液會達到飽和。因此，在本實驗條件下，分別選擇超聲功率400 W、超聲時間10 min和料液比1∶80（g/mL）為最佳提取參數。

2.2.2 正交試驗結果

表2 超聲輔助提取法正交試驗設計與結果Table 2 Orthogonal array design L9 (33) with experimental results for optimization of UAE conditions

如表2所示，影響昆布多糖提取率的最主因素為超聲功率，主次因素依次為A＞B＞C，最優水平組合為A3B2C3，即超聲功率500 W、超聲時間10 min、料液比1∶90（g/mL）。對最優條件進行3 組平行實驗驗證，昆布多糖的提取率為（5.81±0.00）%。可見，該正交試驗優化結果可靠。

2.3 復合酶法提取昆布多糖

2.3.1 單因素試驗結果

圖3 纖維素酶（A）、果膠酶（B）和木瓜蛋白酶（C）用量對昆布多糖提取率的影響Fig. 3 Effects of cellulase (A), pectinase (B), and papain (C) dosage on the extraction efficiency of polysaccharides by MEE

由圖3A可以看出，隨著纖維素酶用量的增加，昆布多糖提取率逐漸增加，當加入90 000 U/g的纖維素酶時，昆布多糖含量達到最大，當繼續增加纖維素酶的用量，昆布多糖提取率則開始下降。從圖3B可以看出，隨著果膠酶的加入，昆布多糖提取率也是呈現先增加后減少的趨勢，最高點是果膠酶加入量20 000 U/g。由圖3C可知，昆布多糖提取率隨著木瓜蛋白酶的增加而增多，在木瓜蛋白酶的量為90 U/g時達到最大，然后趨于平緩。因此，選擇纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的最適用量分別為90 000、20 000 U/g和90 U/g。

2.3.2 正交試驗結果

表3 復合酶提取法正交試驗設計與結果Table 3 Orthogonal array design L9 (33) with experimental results for optimization of MEE conditions

在固定pH 5、溫度50 ℃、料液比1∶70（g/mL）及時間3 h條件下，考察3 種酶不同配比對昆布多糖提取率的影響，如表3所示。影響昆布多糖提取率最顯著的酶是纖維素酶，然后依次是木瓜蛋白酶和果膠酶。最優水平組合為A1B1C3，即木瓜蛋白酶75 U/g、果膠酶15 000 U/g、纖維素酶108 000 U/g。對最優復合酶組合條件進行3 組平行實驗驗證，昆布多糖的提取率為（14.29±0.02）%，提示該正交試驗優化結果可靠。

2.4 提取方法對昆布多糖溶解性的影響

圖4 提取方法對昆布多糖溶解性的影響Fig. 4 Effects of extraction methods on solubility of polysaccharides from L. japonica

從圖4可以看出，不同提取方法提取的多糖的溶解性有著顯著差異（P＜0.05）。溶解時間隨著溶解溫度的升高而降低。復合酶法的溶解時間顯著低于熱水浸提法和超聲提取法（P＜0.05）。可能是由于復合酶使得多糖的結構疏松，部分糖蛋白中的蛋白質分解，分子質量更小，所以更容易溶解。

2.5 剛果紅實驗結果

圖5 NaOH溶液濃度對剛果紅-昆布多糖絡合物最大吸收波長的影響Fig. 5 Maximum absorption wavelength of Congo red complexes of polysaccharides from L. japonica at various NaOH concentrations

多糖的抗腫瘤活性不僅與多糖分子的一級結構有關，還與多糖分子的高級結構有關，而其中三股螺旋結構是多糖分子中最具有活性的空間構象[30]。通過剛果紅實驗，具有三股螺旋結構的多糖會與剛果紅形成絡合物，使得溶液的最大吸收波長發生變化，由此推測多糖是否具有三股螺旋結構。由圖5可以看出，隨著NaOH溶液濃度的增加，熱水浸提的多糖和復合酶法提取的多糖均是先降低再升高再降低，說明在低濃度NaOH溶液和高濃度NaOH溶液條件下，樣品的螺旋結構解體，是以無規則線團的形式存在，而在濃度0.3 mol/L左右的NaOH溶液條件下，是其三股螺旋結構與剛果紅形成了絡合物，使得最大吸收波長向長波方向移動。

2.6 昆布多糖紫外光譜分析

圖6 提取方法對昆布多糖紫外光譜的影響Fig. 6 UV absorption spectra of polysaccharides from L. japonica extracted by three extraction methods

從圖6可以看出，3 種不同提取方法的昆布多糖的紫外光譜是大體相同的，在波長280 nm處略有吸收峰，說明樣品中含有較少的蛋白質或多肽，這與以上粗多糖中蛋白質含量的測定結果一致。

2.7 不同方法提取多糖對腫瘤細胞的抑制作用

表4 不同提取方法的昆布多糖的抗腫瘤活性Table 4 Antitumor activity of polysaccharides from L. japonica

多糖在抗腫瘤藥物的研究中占有一定的比例，研究表明多種多糖對腫瘤細胞都有一定的效果[31-32]。MTT實驗表明，昆布多糖可以對人乳腺癌細胞MCF-7和人肺癌細胞A549產生抑制作用，并且不同提取方法的昆布多糖的抗癌活性并不相同，結果如表4所示。可見熱水浸提昆布多糖對人肺癌細胞A549無抑制作用，對于人乳腺癌細胞有一定抑制效果，超聲提取昆布多糖正好相反，而酶法提取昆布多糖對2 種腫瘤細胞均具有抑制作用。總體來說，對于人肺癌細胞A549，超聲提取的昆布多糖的IC50最小，說明其對該腫瘤細胞的抑制效果最好，而對于人乳腺癌細胞MCF-7，復合酶法提取而昆布多糖抑制效果最好。該實驗結果表明不同方法提取的多糖結構或包含的活性基團不同，也可能是由于復合酶法提取的昆布多糖雜質含量較少，多糖純度更高以致其生物活性更高。

3 結 論

通過3 種不同提取方法的條件優化，表明復合酶法的昆布粗多糖提取率最高，是由于酶對植物細胞壁發揮了作用，使細胞中的多糖更容易分離出來，進入到溶液中。超聲提取法的提取率稍小于熱水浸提，可能是由于超聲時間相較于熱水浸提的時間較短，并且超聲處理的過程始終是在冰水浴中進行，溫度較低，不利于多糖的溶出。通過3 種方法提取率的比較，為以后昆布多糖的大量提取可靠依據。不同提取方法對昆布多糖的化學組成和溶解性等理化性質以及抗腫瘤活性有顯著的影響，不同提取方法所得多糖的分離純化、結構表征及其與抗腫瘤活性的關系有待進一步深入研究。