響應面法優化天然抗氧化劑抑制調理雞排褪色和脂質氧化工藝

魯 青，黃繼超，朱宗帥，劉冬梅，黃 明,3,*

（1.南京農業大學食品科技學院，農業部肉品加工重點實驗室，肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095；

2.南京農業大學工學院，江蘇 南京 210095；3.南京黃教授食品科技有限公司，江蘇 南京 210095）

雞肉深加工制品占我國雞肉制品的5.8%，遠落后于全球雞肉平均深加工比例（20%）[1]，表明我國調理雞肉在生產加工方面存在很大的上升空間和發展潛力[2]。調理雞排是雞肉精深加工制品中較為流行的一類肉制品，它是以雞胸肉為原料，經切片、整型后，添加適量的調味料和香辛料與之進行滾揉、靜腌等加工工藝，再經油炸、煮制或直接速凍而成的一類調理肉制品。現代工業化生產調理雞排過程中會添加適量的辣椒紅色素到腌制液中，以賦予調理雞排誘人色澤，提高消費者對產品的購買欲。辣椒紅色素不僅是國際上公認的天然色素，還具有鮮艷的顏色、極強的著色力、營養衛生等優點[3-4]，但由于辣椒紅色素具有高度不飽和雙鍵系統[5-6]，其應用到調理雞排中極易發生氧化降解而使產品出現褪色現象。而顏色是評價調理雞排重要的感官指標，當肉制品發生褪色現象，即使有良好的風味和口感也得不到消費者青睞[7]，大大降低產品的商業價值。脂質氧化也是引起肉制品貯藏期間褪色的重要原因[8]。Zakrys等[9]研究發現肉制品紅度值的變化規律與硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值的相關性顯著，脂質氧化可能會引起氧合肌紅蛋白氧化而導致肉制品的紅度值發生變化。

抗氧化劑的添加是抑制辣椒紅色素氧化降解的有效手段，其在低濃度下可有效延緩易氧化生物分子氧化，將其添加到肉制品中還可有效延緩產品品質的劣變[10]。經研究報道發現迷迭香提取物和抗壞血酸均具有抑制辣椒紅色素氧化降解、延緩脂質氧化的特性，且屬于天然抗氧化劑，安全性高。迷迭香提取物是禽肉制品中研究最廣泛的一種天然抗氧化劑，它正逐漸替代合成抗氧化劑，開啟“天然食品”新趨勢[10]。迷迭香提取物中含有迷迭香酸、鼠尾草酸及其他咖啡酸衍生物等物質，能有效穩定自由基和阻斷氧化反應鏈[11]。抗壞血酸是天然存在的具有抗氧化性的多羥基化合物，因其結構中含有還原性強的烯二醇，是一種優良的抗氧化物質。有研究證明抗壞血酸添加到辣椒粉中可以破壞氧化反應鏈而抑制其氧化進程，是重要的斷鏈抗氧化劑[12]；添加到禽肉中可以作為電子供體減少活性氧物質的釋放，抑制肉制品貯藏期間的脂肪氧化[13]。

抗氧化劑對辣椒紅色素穩定性的研究較多，但對肉制品中辣椒紅色素的顏色穩定性報道較少且集中在畜肉制品中，例如陳菁[14]研究抗氧化劑對豬肉糜中辣椒紅色素穩定性的影響；國外有學者探究天然抗氧化劑對辣椒紅薩拉米香腸中紅度值的影響[15]。但是抗氧化劑對冷凍調理雞胸肉中辣椒紅色素和脂質氧化的抑制作用鮮見報道；另一方面，迷迭香提取物和抗壞血酸復合使用時對辣椒紅色素穩定性和雞排脂質氧化的影響也鮮見報道。本實驗以調理雞排為主要原料，探究迷迭香提取物和抗壞血酸添加量對調理雞排褪色和脂肪氧化的影響，通過單因素試驗結合中心組合試驗，優化2 種抗氧化劑保持調理雞排顏色穩定、抑制脂肪氧化的最佳添加量，為加強工業化生產的調理雞排顏色和脂肪氧化穩定性提供工藝參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍雞大胸由江蘇益客食品集團股份有限公司提供，每塊雞胸肉規格為（180±20）g；辣椒紅色素河北省晨光生物科技集團股份有限公司；抗壞血酸（食品級） 河南百盛生物科技有限公司；迷迭香提取物（食品級） 河南豫中生物科技有限公司；2-硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、1,1,3,3-四乙氧基丙烷（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

CHROMA METER CR-400便攜式色差儀 日本Konica Minota公司；ESK125真空滾揉機 德國Kakona GmbH公司；HB-3D多用途食品切片機 北京南常肉食機械有限公司；SIM-F124制冰機 日本三洋電子有限公司；IKA-Ultra-Turrax T-25勻漿機 德國Braun公司；Allegra 64R高速冷凍離心機 美國Beckman公司；M2e多功能酶標儀 德國IKA公司；AUY120型電子分析天平 日本Shimazu公司；萬分之一電子天平美國梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 調理雞排制作的工藝流程

雞胸肉解凍→切片→修整、稱質量→加入腌制液→滾揉→-20 ℃冷凍→包裝→-10 ℃貯藏

1.3.2 操作要點

將冷凍的雞胸肉置于空氣中解凍，待雞胸肉解凍至中心溫度為（-6±2）℃后用切片機切成1 cm厚度的片；剔除表面明顯的脂肪和結締組織，然后將其修整成高×寬×長（1 cm×5 cm×5 cm）的規則方塊；將修整后的雞胸肉平均分為11 組并依次稱質量待滾揉。腌制液在雞胸肉切片前12 h配制好混勻后置于4 ℃冷庫中貯藏待用，待雞胸肉分組稱質量后依次稱取相對應的腌制液質量；并按試驗設計依次稱取不同種類和添加量的抗氧化劑，加入到對應的腌制液中，將腌制液和抗氧化劑攪拌均勻后和雞胸肉塊一同放入滾揉機中進行連續性滾揉30 min。滾揉后將樣品置于4 ℃冷庫中靜腌16 h，然后迅速置于-20 ℃凍庫冷凍24 h，使其中心溫度降至-18 ℃。最終將樣品置于-10 ℃冰箱中貯藏。

滾揉條件：真空度0.08 MPa，轉速30 r/min，轉筒傾角45°，連續式滾揉30 min。

腌制液配方（以1 kg雞胸肉計）：水250 g；食鹽14 g；白砂糖35 g；復合磷酸鹽3 g；大豆分離蛋白10 g；玉米淀粉30 g；色拉油1 g；辣椒紅色素1 g。

1.3.3 單因素試驗

根據GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》，迷迭香提取物在調理肉制品中的最大添加量為0.3 g/kg、抗壞血酸在調理肉中的最大添加量按生產需求適量使用。因此單因素設定的迷迭香提取物和抗壞血酸添加量均為0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 g/kg（以肉質量計）；同時設置不添加抗氧化劑的空白對照組。在第0、40、50、60、70、80天隨機選取樣品測定其紅度（a*）值，在第0、40、80天測定其脂肪氧化值。

1.3.4 響應面優化試驗

綜合單因素試驗結果，根據中心組合試驗設計原理，以迷迭香提取物和抗壞血酸添加量為自變量，調理雞排的a*值和脂肪氧化值為響應值，設計2因素5水平共13 個試驗點的響應面試驗。考察迷迭香提取物和抗壞血酸添加量對調理雞排顏色和脂肪氧化的影響，確定2 種添加劑保持顏色和脂肪氧化穩定性的最佳復配工藝。試驗因素和水平見表1。

表1 響應面優化試驗設計因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in response surface design

1.3.5 驗證實驗

按照單因素試驗和響應面試驗結果獲得的最佳工藝，制作調理雞排，比較和分析第50天時調理雞排的a*值和脂肪氧化值。

1.3.6 肉色測定

使用CR-400（D65光源）色差儀測定調理雞排表面的色澤。色差儀使用前需要用標準白板對色差儀的光源（D65光源）進行校正，在室內光照條件下測定樣品表面的色澤，每個處理組隨機選取10 份大小一致、著色均勻的雞排，每份雞排上隨機取5 個點測定a*值，測定在同一溫度、同一光源的環境下進行。

1.3.7 TBARS值的測定

脂肪氧化的測定參照Salih[16]和Ultrera[17]等的方法并略作修改。稱取5 g絞碎均勻的肉樣于80 mL離心管內，與25 mL 7.5 g/100 mL TCA溶液混合，冰浴條件下9 000 r/min勻漿2 次，每次勻漿20 s，間歇10 s；勻漿后得到的混合液置于冷凍離心機中，于12 000×g、4 ℃離心10 min。準確吸取2 mL離心上清液并加入等體積0.02 mol/L TBA渦旋混勻，用2 mL蒸餾水取代上清液與2 mL TBA混勻后用來調零，隨即置于100 ℃沸水中水浴40 min；加熱后將不同處理組的混合液流水冷卻至室溫后測定其在532 nm波長處吸光度。用不同濃度梯度的1,1,3,3-四乙氧基丙烷稀釋液吸光度制作標準曲線，根據標準曲線方程計算樣品的TBARS值，計算結果表示為1 kg調理雞排中所含有的丙二醛質量（mg/kg）。

1.4 數據統計分析

顏色指標測定重復10 次，脂肪氧化測定重復5 次，數據結果表示為。數值顯著性分析采用SAS 9.2中Duncan's multiple-range test；所有圖形的繪制用Origin 9.0制作；Design-Export 8.0.6軟件設計響應面試驗并分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 迷迭香提取物添加量對調理雞排a*值的影響

由表2可知，迷迭香提取物添加量對調理雞排a*值具有顯著性影響；在相同貯藏時間下，隨著迷迭香提取物添加量的增加，雞排a*值呈現先上升后降低的趨勢；當添加量為0.18 g/kg時，其a*值保持最穩定，貯藏80 d后a*值損失率僅為2.8%，而添加0、0.06、0.12、0.18、0.24、0.3 g/kg處理組a*值依次下降10.7%、7.1%、6.2%、5.7%、5.8%。和空白對照組相比，添加0.06 g/kg處理組的a*值從第60天開始與對照組間沒有顯著差異（P＞0.05）；當迷迭香提取物添加量大于0.06 g/kg時均可顯著提高雞排的a*值，添加量0.24、0.3 g/kg處理組的a*值在貯藏期間的下降率高于0.18 g/kg處理組。

表2 迷迭香提取物添加量對辣椒紅調理雞排a*值的影響（n=10）Table 2 Effect of different concentrations of rosemary extract on redness of prepared chicken steak (n= 10)

2.1.2 迷迭香提取物添加量對調理雞排TBARS值的影響

圖1 迷迭香提取物添加量對辣椒紅調理雞排TBARS值的影響（n= 5）Fig. 1 Effect of different concentrations of rosemary extract on TBARS value of prepared chicken steak (n = 5)

如圖1所示，第0天時，不同處理組雞排TBARS值之間沒有顯著差異；第40天時，添加迷迭香提取物處理組TBARS值顯著低于空白組（P＜0.05），但不同迷迭香提取物添加量之間無顯著差異（P＞0.05）；第80天，迷迭香提取物處理組的TBARS值顯著低于空白組，添加量0.18、0.24、0.3 g/kg處理組間沒有顯著差異，但顯著低于添加量0.06、0.12 g/kg處理組，說明當迷迭香提取物添加量為0.18～0.30 g/kg時，對調理雞排的抗氧化效果較佳。綜合不同迷迭香提取物添加量調理雞排a*值和脂肪氧化值的變化，判定迷迭香提取物添加量為0.18 g/kg時最佳。

2.1.3 抗壞血酸添加量對調理雞排a*值的影響

如表3所示，和空白對照組相比，添加抗壞血酸的處理組在貯藏過程中（包括初始值）保持顯著高的a*值（P＜0.05）。抗壞血酸添加量為0.24 g/kg處理組的a*值最高，并且在第70天時顯著高于其他處理組；0.06、0.12、0.18、0.30 g/kg處理組在整個貯藏期內沒有顯著差異，a*值介于空白對照組和0.24 g/kg處理組之間。

表3 抗壞血酸添加量對辣椒紅調理雞排a*值的影響（n=10）Table 3 Effect of different concentrations of ascorbic acid on redness of prepared chicken steak (n= 10)

2.1.4 抗壞血酸添加量對調理雞排TBARS值的影響

圖2 抗壞血酸添加量對辣椒紅調理雞排TBARS值的影響（n=5）Fig. 2 Effect of different concentrations of ascorbic acid on TBARS value of prepared chicken steak (n = 5)

由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，不同處理組調理雞排TBARS值均顯著提高，抗壞血酸可不同程度地抑制雞排貯藏過程中的脂肪氧化。第0天時，不同處理組間沒有顯著差異；第40天時，添加抗壞血酸處理組TBARS值顯著低于對照組，但不同添加量處理組間無顯著差異；第80天時，添加量0、0.06、0.12、0.18、0.24、0.3 g/kg處理組TBARS值分別提高27.5%、23.7%、25.5%、20.3%、19.0%、19.9%，添加量0.18、0.24、0.3 g/kg處理間沒有顯著差異，0.12 g/kg與0.06 g/kg間沒有顯著差異；隨著抗壞血酸添加量的增加，脂肪氧化抑制率有顯著提高，綜合不同抗壞血酸添加量調理雞排的a*值和脂肪氧化值的變化，判定抗壞血酸最佳添加量為0.24 g/kg。

2.2 響應面試驗分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件中的中心組合試驗設計，試驗組合與結果如表4所示。

表4 響應面試驗設計與結果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.1a*值回歸模型分析

根據試驗結果，擬合獨立變量和響應值a*值的二次多項式方程：Y=-11.87+96.34A+186.23B+2.80AB-250.38A2-353.51B2。二次多項式模型R2值為0.932 0，校正系數R2Adj值為0.883 4，說明回歸模型能解釋93.20%響應值的變化，僅有總變異的6.8%不能用此模型解釋。此模型精密度為13.306，說明該回歸模型擬合結果良好。

如表5所示，回歸模型F值為19.19，P＝0.000 6＜0.01，說明該模型極顯著；失擬項F值為2.45，P＝0.203＞0.05，說明此模型建立有效。因此可用上述回歸模型分析和預測迷迭香提取物和抗壞血酸對調理雞排a*值影響的結果。調理雞排a*值回歸模型系數顯著性結果顯示，迷迭香提取物添加量的一次項A對a*值回歸模型影響顯著（P＜0.05），抗壞血酸添加量一次項B和二次項B2對a*值回歸模型影響極顯著（P＜0.01），迷迭香提取物添加量二次項A2以及和抗壞血酸添加量之間的交互項（AB）影響不顯著（P＞0.05）。

表5 a*值回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance for a* value

從圖3可以看出，迷迭香提取物和抗壞血酸添加量對雞排a*值的互作效應。雞排a*值隨迷迭香提取物添加量的增加而升高；當抗壞血酸添加量在0.216～0.264 g/kg范圍時，雞排a*值和抗壞血酸添加量成正比。圖3顯示，等高線偏向于圓形，也驗證迷迭香提取物和抗壞血酸添加量間交互作用對雞排a*值無顯著交互效應（P＞0.05）。

圖3 迷迭香提取物、抗壞血酸添加量及其交互作用對調理雞排a*值影響的等高線和響應面圖Fig. 3 Response surface and contour plots showing the interactive effect of rosemary and ascorbic acid and on redness of prepared chicken steak

2.2.2 TBARS值回歸模型的分析

根據試驗結果擬合獨立變量和響應值TBARS值之間的經驗聯系，得到二次多項式方程：Y（TBARS值）=1.25-11.07A+2.03B-45.72AB+63.54A2+14.04B2。二次多項式回歸模型的R2值為0.886 3，校正系數值為0.805 1，表示回歸模型可以說明88.63%響應值的變化，其中總變異的11.37%不能解釋此模型。此模型精密度為9.664，大于4.0，視為合理且擬合程度良好。

如表6所示，回歸模型的F值為10.91，P值為0.003 3小于0.01，說明該模型極顯著；失擬項F值為4.46，P值為0.091 2大于0.05，表示模型建立有效，因此可用該模型來預測和分析迷迭香提取物和抗壞血酸添加量對調理雞排脂肪氧化的抑制作用。TBARS值回歸模型系數的顯著性結果表明迷迭香提取物添加量的一次項A對該模型影響極顯著（P＜0.01），抗壞血酸添加量二次項B2對TBARS值回歸模型影響顯著（P＜0.05），一次項B、二次項A2以及二者交互作用AB對該模型影響不顯著（P＞0.05）。

表6 脂肪氧化（TBARS值）的回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance for TBARS value

如圖4所示，TBARS值隨著迷迭香提取物添加量的增加而減小；抗壞血酸添加量為0.216～0.245 g/kg時，TBARS值隨著添加量的增加而減小，當添加量大于0.245 g/kg時，隨添加量增大而增大。從圖4等高線可知，迷迭香提取物和抗壞血酸添加量對雞排TBARS值無顯著互作效應（P＞0.05）。

圖4 迷迭香提取物、抗壞血酸添加量及其交互作用對調理雞排TBARS值影響的等高線和響應面圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactive effect of rosemary and ascorbic acid on TBARS value of prepared chicken steak

2.3 響應值優化驗證

利用軟件Design-Expert 8.0.6，在迷迭香提取物、抗壞血酸添加量體系中，設定a*值最大、TBARS值最小，優化得出最佳試驗參數：迷迭香提取物添加量0.198 g/kg、抗壞血酸添加量0.255 g/kg。將響應面法優化得到的組合設為實驗組，單因素試驗獲得的最佳值設為對照組，測定其貯藏50 d后雞排的a*值和TBARS值。如表7所示，響應面優化的最佳試驗參數是可靠的。

表7 驗證實驗結果Table 7 Results of confirmatory experiments

3 結論與討論

3.1 迷迭香提取物和抗壞血酸添加量對調理雞排a*值的影響

有研究[15,18]報道迷迭香提取物可以顯著提高辣椒紅色素貯藏過程中的穩定性。Gomez等[18]向紅肉中加入2 種不同類型的辣椒粉，每種辣椒粉中分別設置添加迷迭香處理組和空白組，結果發現2 種添加迷迭香提取物處理組的a*值均顯著高于空白組；而辣椒紅色素是辣椒粉呈紅色的主要來源物質[19]，由此可判斷迷迭香的添加可顯著提高辣椒紅色素的穩定性。本實驗中添加迷迭香提取物可顯著增加調理雞排貯藏期間的a*值，但0.24、0.3 g/kg處理組調理雞排的a*值下降速率高于0.18 g/kg處理組。Rohlik等[15]在研究辣椒紅薩拉米香腸貯藏期間a*值的變化，結果發現添加量0.5 g/kg迷迭香提取物處理組在光照和黑暗條件下的a*值低于空白對照組，推測原因是由于迷迭香提取物添加量過高會促進辣椒紅色素的降解，與本實驗結果類似。

辣椒中的抗壞血酸成分對辣椒紅色素的穩定性起到關鍵作用[20]；外源添加抗壞血酸對辣椒紅色素穩定性的研究主要集中于辣椒粉制品中。Morais等[21]在辣椒粉中添加不同濃度的抗壞血酸，然后置于不同環境中貯藏，結果顯示添加抗壞血酸可顯著保持辣椒粉中辣椒紅色素含量的穩定，且作用強度和抗壞血酸濃度成正比。Shin等[22]研究發現向雞肉腸中加入0.02%抗壞血酸可顯著增加其貯藏期間的a*值。抗壞血酸主要是通過AscH-為自由基提供電子供體而起到清除自由基的作用[23]，但pH值大小對AscH-活性影響顯著，當酸性過高，大多數抗壞血酸以AscH2形式存在，從而大大降低其抗氧化性。本實驗中0.24 g/kg處理組調理雞排a*值的穩定性大于0.3 g/kg處理組，可能是由于抗壞血酸添加量過高，雞排表面腌制液成分酸性偏高，導致對辣椒紅色素的抗氧化性減弱，保護色素穩定性能力降低，也有類似研究[24]報道抗壞血酸添加過量會引起pH值下降而引起產品褪色，具體作用機理需要進一步進行驗證。

3.2 迷迭香提取物和抗壞血酸添加量對調理雞排TBARS值的影響

迷迭香提取物抑制肉中脂肪氧化的機理主要包括以下2 種作用方式：一是迷迭香提取物中的迷迭香酚、迷迭香酸以及鼠尾草酸等成分能代替氧自由基和不飽和脂肪酸結合，從而抑制肉品中脂肪發生氧化反應[25-26]；二是迷迭香提取物中的酚類物質如迷迭香酚可通過螯合金屬離子而阻斷自由基與不飽和脂肪酸的反應鏈，避免脂質氧化[27]。本實驗結果顯示當迷迭香提取物添加量為0.18～0.3 g/kg時，抑制雞排氧化效果最好且沒有顯著差異。Rohlik等[11]在蒸煮香腸中添加0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 g/kg迷迭香提取物，結果發現當迷迭香提取物添加量為0.2～0.3 g/kg時，抗氧化效果最佳且沒有顯著差異，與本實驗研究結果相似。賈娜等[28]研究迷迭香提取物對牛肉丸貯藏過程中TBARS值的影響，結果發現，凍藏30 d后，迷迭香添加量為0.02%～0.04%時，牛肉丸TBARS值沒有顯著差異；第60天時0.04%處理組顯著低于0.02%處理組。而李婷婷等[29]研究大黃魚經不同添加量迷迭香提取物浸泡處理后，發現迷迭香添加量0.1%、0.2%、0.3%處理組均可顯著抑制魚肉脂肪氧化，且不同添加量處理組間沒有顯著差異。不同肉類的脂肪含量和差異較大，迷迭香添加量對其影響規律也不完全一致。

抗壞血酸具有抗氧化性能，但它既可以作為抗氧化劑，又可作為促氧化劑，這取決于其濃度、金屬離子存在和生育酚含量[30]。Sánchez-Escalante等[31]探究天然抗氧化劑對牛肉餅貯藏期的品質變化中發現，單獨使用抗壞血酸時，沒有表現出顯著抗氧化性，當其和迷迭香提取物混合使用時可顯著降低牛肉餅的抗氧化性。Mitsumoto等[32]向碎牛肉中加入500 mg/kg抗壞血酸可以抑制脂質過氧化；相反，Benedict等[33]實驗發現50 mg/kg抗壞血酸加入到牛肉中可以增加脂質過氧化。本實驗結果發現，抗壞血酸添加量在0.3 g/kg內可抑制脂質氧化，且和迷迭香提取物共同使用時對TBARS值變化沒有顯著交互作用。

本實驗將不同添加量迷迭香提取物和抗壞血酸添加到雞排中，a*值和TBARS值作為響應值，應用中心組合試驗擬合得到2 個二次多項式模型，準確反映各影響因子和響應值之間的函數關系，2 個模型的決定系數R2分別為0.932 0、0.886 3，擬合度高，結果更為準確可靠。優化得到有效抑制雞排貯藏過程中的脂肪氧化和褪色速率的最佳抗氧化劑復配比，即迷迭香提取物添加量0.198 g/kg、抗壞血酸添加量0.255 g/kg。在此工藝條件下，測得調理雞排a*值為21.88，TBARS值為0.59 mg/kg，與擬合結果一致。該工藝條件下制作的調理雞排在貯藏過程中a*值的穩定性較如今工業化生產有顯著提高，脂肪氧化速率顯著下降，有效保持產品的商業價值，為調理雞排工業化生產貯藏顏色和脂肪氧化的穩定性提供理論依據。