淫羊藿苷通過Wnt/β-catenin信號通路對卵巢癌細胞CAOV3增殖的影響

陳 茹 蘇 瑩 柳 江

在婦科惡性腫瘤中，卵巢癌屬于高發類型，在全球范圍內，卵巢癌在女性癌癥病死率中占第15位[1]。近年來卵巢癌的發生率呈逐年升高的趨勢，并且其具有病程發展迅速，病死率高的特點。由于卵巢癌在早期沒有典型的臨床病癥、腫瘤細胞增殖速度迅速及惡化程度極高、沒有準確性較高的腫瘤標志物等有效的篩查手段等原因，在確診卵巢癌時已經有約70%的病例處于晚期[2]。目前，臨床上對于卵巢癌的治療手段多數以手術為主化療為輔，但治療效果仍然不容樂觀[3]。

Wnt屬于分泌性糖蛋白家族，是調控細胞增殖、細胞分化、細胞遷移及細胞極性的關鍵信號分子。當Wnt信號通路發生異常調節時，可引起免疫機制的失衡，并參與腫瘤的發生、發展[4]。β-catenin屬于一種多功能胞質蛋白，在Wnt信號通路中起到重要作用，不僅是Wnt信號轉導通路的關鍵調控點，還是上皮鈣黏素復合體的主要成分[5～7]。在生理狀態下，胞質內的大部分β-catenin參與細胞黏附，而當Wnt信號通路激活后可抑制β-catenin的降解及磷酸化，使得多余的β-catenin與核內的轉錄因子結合，啟動與細胞增殖有關的基因發生轉錄[8～10]。因此，Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤的發生、發展有著密切的關系。

淫羊藿含有多種藥理活性成分，除了一些必需微量元素外，主要含有生物堿、黃酮類等化合物。中藥淫羊藿具有多種藥理活性，如增強性腺功能、提高機體免疫力、抗氧化延緩衰老等作用，其中淫羊藿苷(icariin)屬黃酮類化合物，是淫羊藿的主要活性成分之一[11]。有研究報道證實，淫羊藿苷可抑制腫瘤細胞增殖及惡化，誘導癌細胞凋亡，但關于淫羊藿苷對卵巢癌的研究報道較為少見[12]。

本實驗旨在研究淫羊藿苷對人卵巢癌細胞CAOV3生長抑制及過程中可能的相關機制，為淫羊藿苷在臨床上對卵巢癌的治療奠定基礎。

資料與方法

1.材料和試劑: 淫羊藿苷、MTT(Sigma，Saint Louis，MO，USA)；人卵巢癌細胞CAOV3(中國科學院細胞庫，上海，中國)；GAPDH、β-catenin、c-myc和cyclinD1人一抗、HRP標記二抗(武漢三鷹生物技術有限公司，武漢，中國)；DMEM(Gibco，Carlsbad，CA，USA)；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光實時定量PCR(RT-PCR)試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，引物合成(TaKaRa，大連，中國)；BCA蛋白定量試劑盒、細胞裂解液(碧云天生物技術研究所，南通市，中國)。

2.細胞培養:人卵巢癌細胞CAOV3在37℃、5%CO2的條件下孵箱中培養，培養細胞數量達85%融合時，胰酶消化處理后，用DMEM(含10%胎牛血清)培養基稀釋細胞懸液，將細胞目的濃度調整為2×108/L，計數后接種于對應的培養板中，備后續實驗使用。

3.檢測細胞增殖抑制率:淫羊藿苷處理細胞后MTT比色測定細胞增殖能力：將細胞CAOV3接種于96孔板中，濃度為1×105/ml，每孔100μl。24h 后加入淫羊藿苷(終濃度分別為10、20、40、60、80μg/ml)，每個濃度重復5個孔，獨立重復6次，對照組不給藥。在37℃、5%CO2的條件下培養孵育24、48 及72h，換去藥液。每孔加入10μl的MTT，濃度為5mg/ml，4h后，通過酶標儀檢測各孔570 nm波長的吸光度(A)值。按以下公式計算細胞抑制率：抑制率(%)=(正常對照組A值-實驗組A值/正常對照組A值)×100%。

4.細胞形態學觀察:將人卵巢癌細胞CAOV3培養好后，分別用含0、20、40和60μg/ml淫羊藿苷的培養液，在37℃、5%CO2的條件下培養24h，各組用倒置顯微鏡(Nikon，Tokyo，Japan)觀察并拍攝細胞形態變化。

5.RT-PCR檢測β-catenin、c-myc和cyclinD1 mRNA的表達:將培養好的細胞接種于6孔板，104個細胞/孔，24h后吸去上清液，分別用含0、20、40和60μg/ml淫羊藿苷的培養液培養24h后，收集各組細胞，依照RNA提取試劑盒說明書中的方法提取待檢組織中的總RNA，采用紫外可見分光光度計(日本Hitachi公司)檢測總RNA的濃度和純度(A260/A280>1.8為合格)。然后按照反轉錄試劑盒說明書方法進行反轉錄得到cDNA，再以cDNA為模板，按照RT-PCR試劑盒說明書方法檢測β-catenin、c-myc和cyclinD1 mRNA的表達。引物序列如表1所示，反應條件為：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，擴增40個循環。從儀器軟件中輸出Ct值，計算相對表達量采用2-△Ct方法，按照下列公式計算：△Ct(目的基因)=Ct(目的基因)-Ct(對照基因)。

表1 RT-PCR引物序列

6.Western blot法檢測β-catenin、c-myc和cyclinD1蛋白的表達: 將培養好的細胞接種于6孔板，104個細胞/孔，24h后吸去上清液，分別用含0、20、40和60μg/ml淫羊藿苷的培養液培養24h后，收集各組

細胞，用細胞裂解液裂解細胞，高速離心機低溫離心15min，收集上清。用BCA試劑盒測定提取蛋白濃度，取50μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，將分離的蛋白電轉移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1h，加入一抗孵育(1∶1000)，4℃過夜。TTBS充分洗膜后，加入二抗(1∶2000)室溫孵育1h，ECL暗室顯影，凝膠成像儀(Bio-Rad Laboratories，California，USA)掃描紀錄，以GADPH作為內參，進行灰度分析比較。

結 果

1.淫羊藿苷對CAOV3細胞增殖抑制的影響:分別用含0、10、20、40、60、80μg/ml淫羊藿苷的培養液培養24、48、72h后，各組中均可顯著抑制CAOV3細胞的增殖，隨著濃度和時間的增加，增殖抑制率明顯升高(P<0.01)，并呈現出明顯的劑量依賴性。詳見表2。在本研究的后續實驗中選取20、40、60μg/ml淫羊藿苷作為給藥濃度，作用時間為24h。

表2 不同濃度淫羊藿苷對CAOV3細胞的增殖抑制作用

2.淫羊藿苷對CAOV3細胞形態的影響:如圖1所示，與對照組比較，分別用含20、40、60μg/ml淫羊藿苷的培養液培養24h后，各組中細胞形態明顯改變，細胞皺縮，貼壁不牢，增殖細胞數明顯得到抑制，并且具有明顯的劑量依賴性。

圖1 不同濃度的淫羊藿苷處理24h后，倒置顯微鏡下觀察淫羊藿苷對CAOV3細胞形態的影響

3.淫羊藿苷對β-catenin、c-myc和cyclinD1 mRNA水平的影響:如圖2所示，分別用含20、40、60μg/ml淫羊藿苷的培養液培養24h后，與對照組比較，各組中cyclinD1 mRNA 表達量、c-myc和cyclinD1 mRNA水平均被顯著抑制(P<0.01)。

圖2 RT-PCR檢測淫羊藿苷對CAOV3細胞β-catenin、c-myc和cyclinD1 mRNA的表達水平的影響

4.淫羊藿苷對β-catenin、c-myc和cyclinD1 蛋白表達水平的影響:分別用含20、40、60μg/ml淫羊藿苷的培養液培養24h后，與對照組比較，各組中β-catenin、c-myc和cyclinD1蛋白表達水平也被顯著抑制 (P<0.01)，且具有一定的濃度依賴性(圖3)。

圖3 Western blot法檢測淫羊藿苷對CAOV3細胞β-catenin、c-myc和cyclinD1的蛋白結果

討 論

卵巢癌以其惡化程度高，病情進展迅速為特點，是病死率較高的婦科惡性腫瘤，而早期缺乏有效的篩查手段以及長期有效的治療方案的缺乏是卵巢癌病死率居高不下的原因。因此，尋找新的有效的治療方法一直以來都是卵巢癌研究領域的熱點。

β-catenin作為一種細胞間的黏附分子，當其存在于細胞膜上時有參與細胞黏附的功能，一旦發生細胞核的轉位或被降解，黏附活性則消失[13]。有研究表明β-catenin不僅有介導細胞黏附的功能，還具有信號轉導作用，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活是人類腫瘤發生的重要機制之一，β-catenin的過度表達也是此信號通路激活的主要表現[14]。原癌基因cyclinD1和c-myc，在細胞的增生、分化與凋亡過程中起到重要作用，并且與多種腫瘤發生、發展有關。近年來研究顯示，cyclinD1、c-myc在Wnt信號通路中是非常重要的靶基因，免疫組化研究證實在多種腫瘤中cyclinD1、c-myc、β-catenin的異常表達和Wnt信號通路激活有關，Wnt信號途徑激活時，進入細胞核的β-catenin增加，進一步活化cyclinD1和c-myc等基因的表達，促進細胞增殖[15，16]。在細胞核內，如果β-catenin異常蓄積并活化基因時，β-catenin基因就成了癌基因，已有研究證明β-catenin與多種消化系統、血液系統、生殖系統的腫瘤發生有關[17]。

本實驗中在卵巢癌細胞CAOV3中分別加入不同終濃度的淫羊藿苷，24、48及72h后檢測指標。MTT檢測結果顯示，與對照組比較，淫羊藿苷能顯著抑制細胞CAOV3的活性，隨著濃度和時間的增加，增殖抑制率明顯升高，并呈現出明顯的濃度依賴性。淫羊藿為一種常見中藥，具有免疫調節、延緩衰老等作用，在大量肝癌、乳腺癌等疾病的研究中淫羊藿苷有明顯的抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡的作用[18，19]。目前，對淫羊藿苷抑制卵巢癌細胞CAOV3增殖的作用機制尚未完全明確，推測可能是通過改變CAOV3細胞膜生化特性、使其細胞周期相的S期減小，影響其生理活動和物質代謝進而抑制CAOV3細胞生長。國外有相關研究表明淫羊藿苷可明顯調節影響肺癌惡性增殖的JAK2/STAT3信號通路的活性[20]。結合本研究結果，證明淫羊藿苷在體外具有抑制CAOV3細胞增殖的作用。倒置顯微鏡下發現淫羊藿苷處理以后，增殖的CAOV3細胞數目減少，形態發生明顯變化，細胞逐漸皺縮，從細胞形態學上進一步證明淫羊藿苷在體外具有明顯抑制CAOV3細胞生長的作用。分析其原因，可能是隨著淫羊藿苷濃度的增加及藥效的深入，抑制CAOV3細胞增殖的效果增強，加劇CAOV3細胞的凋亡，明顯降低其遷徙能力，因而在形態學上表現出明顯的細胞逐漸皺縮并數目減少。

RT-PCR檢測結果表明，淫羊藿苷可降低β-catenin mRNA的表達以及抑制Wnt信號通路靶基因c-myc和cyclinD1 mRNA的表達，分析原因可能為cyclinD1為特異性周期蛋白，在正常細胞的增殖和生長過程中起著主要作用，其過度表達是多種原發性惡性腫瘤的特征；c-myc是myc基因家族的重要成員之一，是一種可使細胞無限增殖、促進細胞分裂的基因，其低表達，能使細胞生長停滯、促進細胞分化。cyclinD1和c-myc在Wnt信號通路中起著核心作用，兩者共同影響腫瘤疾病的進展，β-catenin基因則主要通過激活cyclinD1而參與腫瘤的發生。

淫羊藿苷對細胞周期有特異的阻斷作用，能干擾和抑制DNA的復制與合成，殺傷處于增殖期的細胞。因此，淫羊藿苷抑制癌細胞增殖的作用可能是通過抑制β-catenin、c-myc和cyclinD1 mRNA水平的表達。Utsuki等[21]對患者腫瘤組織中cyclinD1和β-catenin的表達水平進行分析發現，隨著腫瘤的惡化，cyclinD1和β-catenin的mRNA表達水平逐漸升高。此外，還有研究發現，腎母細胞瘤細胞中β-catenin、cyclinD1和c-myc mRNA的陽性表達率較正常腎組織明顯升高，說明β-catenin、cyclinD1和c-myc mRNA的高表達在腎母細胞瘤形成中可能起著重要作用[22]。其研究結論與本研究相結合能夠更好的說明淫羊藿苷的作用機制是通過降低β-catenin、cyclinD1和c-myc的表達，并且Western blot法檢測結果同時也表明淫羊藿苷可下調β-catenin、c-myc和cyclinD1的蛋白表達。表明淫羊藿苷能夠下調β-catenin、c-myc和cyclinD1蛋白，使其不能與核內的轉錄因子結合，進而影響細胞的增殖。Li等[23]研究表明，淫羊藿苷能夠通過作用于microRNA-21進而影響PTEN、RECK和Bcl-2蛋白的表達，抑制腫瘤細胞的增殖，并誘導腫瘤細胞發生凋亡。本研究發現淫羊藿苷抗腫瘤的新的作用機制，即通過降低β-catenin、c-myc和cyclinD1的表達，產生抑制腫瘤細胞增殖的作用。本實驗結果可為淫羊藿苷對卵巢癌的藥物治療作用提供一定的理論基礎。

綜上所述，本研究證明淫羊藿苷可以抑制人卵巢癌CAOV3細胞株的增殖，其作用機制可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來實現的。