干擾整合素轉接激酶表達對口腔鱗癌細胞遷移侵襲影響研究

宋瑋華 劉月華 關 超 李 強

口腔鱗癌是一種發生于口腔的常見惡性腫瘤，據統計在所有的口腔癌患者中有80%為口腔鱗癌，其在世界范圍內的發生率仍然呈現逐年上升的趨勢。隨著醫學的不斷發展，口腔鱗癌的治療取得了一定的進步，但由于口腔鱗癌具有早期發病隱匿等特點，提高口腔鱗癌患者的生存率仍然是目前研究的熱點[1]。隨著基因技術的不斷發展，靶向基因治療已經成為癌癥治療的主要研究方向。整合素轉接激酶(integrin-linked kinase，ILK)屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要分布于細胞質中[2]。有研究表明，ILK在膀胱癌、舌鱗癌等多種癌癥中高表達，具有促進癌細胞的增殖、影響癌細胞的轉移的作用[3,4]。本研究通過下調口腔鱗癌細胞中ILK的轉錄和表達水平，用MTT法、Western blot法等多種實驗方法研究沉默ILK對口腔鱗癌細胞轉移潛能的影響，為靶向ILK治療口腔鱗癌提供新的思路。

材料與方法

1.實驗材料：ILK多克隆抗體購自于武漢艾美捷生物科技有限公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購自于北京普利萊基因技術有限公司；基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotease 9,MMP-9)單克隆抗體購自于英國Santa Cruz公司；Lipofectamine 2000、Realtime PCR 試劑盒均購自于美國Invitrogen公司；ILK、GAPDH引物均由上海生工生物公司合成；基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotease 2,MMP-2)單克隆抗體購自于英國Abcam公司；ILK小干擾RNA(ILK siRNA)和小干擾RNA陰性對照(siRNA control)購自于上海吉瑪生物制藥有限公司；胎牛血清、RPMI1640培養基、胰蛋白酶均購自于美國Gibco公司；口腔鱗癌細胞SCC-25購自于中國科學院細胞庫。

2.細胞培養：口腔鱗癌SCC-25細胞培養條件為：37℃，5%CO2培養箱，飽和濕度。細胞培養液用含有10%胎牛血清的RPMI1640。取出保存于液氮中的SCC-25細胞，在37℃融化后，接種到細胞瓶中，觀察細胞密度超過90%時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代培養。

3.細胞轉染及分組：在轉染前的24h，將對數生長期的SCC-25細胞以每孔5×104個細胞接種到6孔細胞培養板中。將250μl的Lipofectamine 2000與7.5μl的siRNA control和ILK siRNA分別混合后，在室溫條件下孵育20min。加入到6孔細胞培養板中，在37℃，5% CO2培養箱中培養48h。分別將轉染siRNA control和ILK siRNA后的SCC-25細胞記為si-NC組和ILK siRNA組，同時以沒有轉染的SCC-25細胞作為對照組。

4.RT- PCR 檢測轉染后細胞中ILK mRNA表達：取對照組、si-NC組和ILK siRNA組細胞，培養48h后，按照每兩個6孔細胞培養板中的細胞加入1mL Trizol進行裂解。充分裂解后，加入1/5裂解液體積的氯仿溶液，混合后，12000r/min，4℃離心10min。吸取上層水相溶液，加入1/2體積的異丙醇，在室溫條件下靜置15min，4℃離心10min，12000r/min，將上清液吸除后，加入1ml的75%的乙醇洗滌RNA兩次后，放在室溫環境下干燥，用無RNase的水溶解RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度。反轉錄合成cDNA，按RT-PCR 試劑盒說明書檢測ILK水平，每組設置5個復孔，實驗重復3次。反應程序為：95℃，5min；95℃，15s；65℃，35s，40個循環周期。ILK上游引物：5′-GACGACATTTTCACTCAGTGCC-3′，下游引物：5′-ACGGTTCATTACATTGATCCGTG-3′。GAPDH上游引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。

5.Western blot法檢測轉染后細胞中ILK蛋白表達：取對照組、si-NC組和ILK siRNA組細胞，加入1ml的裂解液，在冰上裂解20min后，吸取勻漿液到離心管中，超聲后，9000r/min，離心10min，吸取上清液，用BCA法對蛋白樣品進行定量檢測。按照蛋白樣品：5×Loading Buffer=5∶1的體積比例混合后，煮沸3min。按照每孔加入50μl的樣品進行蛋白電泳，電泳電壓為120V恒壓。轉膜：300mA，轉膜70min。在5% 脫脂奶粉中封閉60min，與1∶1000倍稀釋的一抗在4℃過夜反應后，1∶2000倍稀釋的二抗在室溫反應60min。顯色后，以目的蛋白灰度值÷GAPDH灰度值表示蛋白水平，實驗重復3次，取均值。

6.MTT檢測細胞增殖：取對照組、si-NC組和ILK siRNA組細胞，接種到96孔板中，每孔加入103個細胞，培養48h。在每孔中加入MTT溶液20μl(5mg/ml)，在37℃孵育4h后，棄去上清液，加入150μl的二甲基亞砜溶液，搖床反應10min。酶標儀分析570nm的吸光度值(A值)。每組設置6個復孔，實驗重復3次。分別按照下面的公式計算分析各組細胞的存活率。ILK siRNA組或si-NC組存活率(%)=(ILK siRNA組或si-NC組A值÷對照組A值)×100%。

7.Transwell小室檢測細胞侵襲：在侵襲實驗前在6孔Transwell小室中加入基質膠在37℃孵育30min。將對照組、si-NC組和ILK siRNA組細胞用無血清的培養液配制成5×104個/毫升的細胞懸浮液。取1ml的含血清細胞培養液加入到下室中，同時在上室中添加2ml的上述細胞懸液。培養48h后，用棉簽把沒有穿膜的細胞擦掉，用乙醇固定20min，結晶紫染色后，在顯微鏡下隨機選取5個視野進行細胞計數，實驗重復3次，取均值。

8.細胞劃痕實驗檢測細胞遷移：取對照組、si-NC組和ILK siRNA組細胞，接種到6孔細胞培養板中，每孔中加入2×104個細胞。培養24h后，取移液槍槍頭，在長滿細胞的瓶壁上小心的劃出一條細痕，再加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)將劃下來的細胞洗掉后，繼續培養48h。分別在0h和48h觀察劃痕寬度。每組設置3個復孔，實驗重復3次，取均值。遷移率(%)=100%×(0h寬度-48h寬度)÷0h寬度。

9.Western blot法測定各組MMP-2、MMP-9蛋白水平：分別取上述的對照組、si-NC組及ILK siRNA組細胞，培養48h后，檢測MMP-2和MMP-9蛋白水平。

結 果

1.轉染后細胞中ILK表達檢測結果：結果見表1、圖1中所示，對照組、si-NC組、ILK siRNA組ILK mRNA水平依次為1.02±0.08、0.99±0.11、0.45±0.04，蛋白水平依次為0.45±0.05、0.46±0.07、0.18±0.03。si-NC組ILK mRNA水平及ILK 蛋白水平同對照組比較，差異無統計學意義(tmRNA=0.382，PmRNA=0.722，t蛋白= 0.201，P蛋白=0.850)。ILK siRNA組ILK mRNA水平及ILK 蛋白水平較對照組和si-NC組明顯下降(tmRNA=11.038、7.991，PmRNA=0.000、0.001，t蛋白=8.020、6.368，P蛋白=0.001、0.003)。

表1 轉染后的口腔鱗癌SCC-25細胞中ILK mRNA和蛋白水平

圖1 轉染后細胞中ILK表達

2.細胞增殖檢測結果：對照組、si-NC組、ILK siRNA組細胞存活率依次為：99.94%±7.35%、100.01%±6.98%、52.64%±2.06%(F=62.829，P=0.000)。si-NC組細胞存活率與對照組比較,差異無統計學意義(t存活率= 0.012，P存活率=0.991)。ILK siRNA組細胞存活率明顯低于對照組和si-NC組，差異有統計學意義(t存活率=10.733、11.274，P存活率=0.000、0.000)。

3.細胞侵襲遷移檢測結果：結果見圖2中所示，對照組、si-NC組、ILK siRNA組細胞遷移率依次為45.32%±5.25%、46.02%±4.10%、16.87%±3.72%，侵襲細胞數目依次為136.69±12.54、138.25±11.05、62.38±8.64。si-NC組細胞遷移率、侵襲細胞數目與對照組比較差異無統計學意義(t遷移率=0.182，P遷移率=0.864，t侵襲數目=0.162，P侵襲數目=0.879)。ILK siRNA組口腔鱗癌細胞的遷移率和侵襲細胞的數目都低于對照組和si-NC組(t遷移率=7.658、9.120，P遷移率=0.002、0.001 ，t侵襲數目= 8.452、9.369，P侵襲數目=0.001、0.001)。

圖2 細胞遷移和侵襲結果(×40)

4.細胞中MMP-2、MMP-9表達檢測結果：結果見圖3中所示，對照組、si-NC組、ILK siRNA組MMP-2水平依次為0.25±0.05、0.26±0.04、0.08±0.01，MMP-9水平依次為0.43±0.08、0.42±0.09、0.09±0.02。si-NC組MMP-2、MMP-9與對照組比較差異無統計學意義(tMMP-2= 0.271，PMMP-2=0.800，tMMP-9=0.144，PMMP-9=0.893)。ILK siRNA組MMP-2、 MMP-9明顯低于對照組和si-NC組，差異有統計學意義(tMMP-2=5.775、7.562，PMMP-2=0.005、0.002，tMMP-9=7.141、6.200，PMMP-9=0.002、0.003)。ILK表達下調能夠抑制口腔鱗癌SCC-25細胞中MMP-2、MMP-9的表達。

圖3 MMP-2、MMP-9表達水平

討 論

ILK是一種較為保守的細胞內信號相關蛋白，其主要通過調控絲氨酸/蘇氨酸活性影響細胞的生長過程，參與腫瘤的發生和發展[5,6]。安陽等[7]通過檢測89例肝細胞肝癌患者癌組織及65例正常肝組織中ILK表達發現，ILK在肝癌中的表達水平升高。朱向陽等[8]研究表明，宮頸癌組織中ILK的陽性率高達86%，而正常的宮頸組織中ILK的陽性率僅有23%。魏寅生[9]通過RT-PCR和Western blot法分別檢測膀胱癌組織和癌旁組織中ILK mRNA和蛋白表達水平發現，ILK在膀胱癌中表達上調，而干擾ILK表達后，膀胱癌細胞T24凋亡增多，增殖、遷移、侵襲及黏附能力均下降。Que等[10]研究表明，下調ILK表達后，舌鱗癌細胞凋亡增加，同時細胞中上皮間質相關蛋白表達也發生改變, 以上的研究報道提示ILK在癌癥組織中表達上調，并且能夠調控癌細胞的生長過程。本研究結果顯示，干擾ILK表達后的口腔鱗癌細胞增殖受到抑制，侵襲能力下降，遷移能力也明顯下降, 這與之前的研究報道相符合，說明在口腔鱗癌細胞中干擾ILK同樣能夠抑制腫瘤生長和轉移，對口腔鱗癌沒有發現特異性。

相關調控機制研究表明，ILK參與調控癌細胞生長、轉移、侵襲等功能有多種途徑，如管永昱等研究表明，ILK在口腔鱗狀細胞癌中高表達，可能通過促進腫瘤血管生成，促進腫瘤細胞浸潤和轉移[11]。動物實驗表明，沉默ILK后能夠有效抑制人舌鱗癌細胞在體內的轉移和增殖能力，其作用機制可能是通過抑制與EMT相關蛋白表達、調控ILK/Akt/GSK3β/Snail通路[12]。癌細胞的侵襲和遷移是癌癥轉移的基礎，是一個極為復雜的過程，受到多種基因和蛋白的共同調控作用。癌細胞通過分泌降解外基質的蛋白酶，進入淋巴管和微血管循環，進而轉移到正常的組織和器官中，引起癌癥的轉移[13～16]。趙明靜等[17]研究證實，ILK過表達可通過調控NF-κB途徑介導MMP-9表達上調，從而促進肺癌細胞侵襲和遷移。基質金屬蛋白酶家族在細胞外基質降解過程中具有重要作用，其至少含有26個家族成員，其中MMP-2、MMP-9是降解Ⅳ型膠原酶的主要蛋白酶，而在細胞外基質中Ⅳ型膠原酶含量最多[18,19]。宋清源等[20]研究表明，沉默MMP-2后，卵巢癌細胞OVCAR-3的侵襲細胞數目從140減少至99，遷移距離從187μm減少至120μm。薄惠等[21]發現黃芩素處理后的口腔鱗狀細胞癌細胞中MMP-2蛋白水平降低，細胞的轉移能力也下降。本研究結果顯示，干擾ILK表達下調口腔鱗癌細胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平，證實下調ILK可以通過下調MMP-2和MMP-9發揮抗口腔鱗癌細胞遷移和侵襲的作用。

以上研究表明，沉默ILK可能通過下調細胞中MMP-2和MMP-9的表達，發揮抗口腔鱗癌細胞侵襲及遷移的作用，并且可以在體外降低口腔鱗癌細胞的增殖活性。這為靶向ILK治療口腔鱗癌提供了理論基礎。本研究只在體外進行了細胞實驗，存在一定的局限性，后續會在體內進行更為深入的探討。