不同方法學檢測急性髓系白血病MPO陽性率的比較及意義

鄭 瑞 章 鴦 陳葆國 沈芝穎 林愛芬

白血病的精準診斷需要多學科(形態學、免疫學、遺傳學和分子生物學)的綜合診斷。目前骨髓細胞涂片形態學仍是基礎，形態學對急性髓系白血病(AML)的分型主要依據1986年的FAB(French-American-Britain)的分型標準。組織化學染色輔助用于白血病的形態學分型，其中髓過氧化物酶(MPO)染色是鑒別髓系白血病的關鍵指標。實際工作中，筆者發現部分AML患者骨髓病理切片、細胞涂片及流式細胞學檢測白血病細胞胞內MPO活性的結果并不一致，本研究通過對這3種方法檢測AML胞內MPO的結果進行比較，探討三者之間的優缺點及臨床意義。

資料與方法

1.一般資料： 對筆者醫院2012年5月～2016年3月初診AML，且均進行骨髓活檢、免疫學分型及骨髓形態學檢查的患者，共計90例，其中男性58例，女性37例，患者年齡1～93歲，中位年齡60.5歲，按FAB分型，詳見表1。

2.檢測方法： (1)骨髓活檢標本MPO染色：①Bouin氏固定液固定過夜；②放入EDTA脫鈣液脫鈣4～5h；③流水沖洗15min，投入脫水機，常規脫水、透明，石蠟包埋切片3μm；④MPO染色：72℃烤片1h，二甲苯脫蠟2缸(10分鐘/每缸)，梯度乙醇脫水(梯度乙醇100%、95%、75%，2分鐘/每次)，PBS洗5次，高壓修復，PBS洗5次，3%雙氧水室溫孵育10min，PBS洗5次，加兔抗人MPO多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)37℃ 1h，PBS洗5次，二抗37℃ 20min、三抗各10min，DAB顯色5～10min，蘇木精復染2min，自來水沖洗，鹽酸酒精分化，逐級梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。中性粒細胞作內對照或陽性標本做陽性對照，用PBS做陰性對照，低倍鏡或高倍鏡判斷，MPO+或MPO少量+均按陽性統計。(2)骨髓涂片MPO染色 ：采用聯苯胺法染色，方法按試劑盒(上海太陽生物技術有限公司)說明書進行：新鮮骨髓涂片滴加Ι液(含聯苯胺等)數滴覆蓋血膜，室溫放置1min，滴加Ⅱ液(含過氧化氫)數滴，混勻后室溫放置5min,流水沖洗，滴加95%乙醇脫色，流水沖洗后瑞士-吉姆薩復染。陽性顆粒呈棕黃或藍黑色，顆粒陽性的原始細胞(包括幼稚單核細胞)>3%為MPO表達陽性。(3)流式細胞術檢測胞內MPO ：抽取骨髓液1.5ml，枸櫞酸鈉抗凝，取2支試管，兩管均加入10μl CD45-PerCP-Cy5.5單抗與50μl EDTA抗凝骨髓液[(1～2)×106個細胞]組合，避光15min。加溶血素2ml避光15min。300×g離心10min ，去上清，加2ml PBS洗一次，棄上清，每管加入100μl固定液(MEDIUM A)(杭州聯科生物技術股份有限公司)，室溫孵育15min，加入2ml PBS洗1次，棄上清，每管加入100μl破膜劑(MEDIUM B)(杭州聯科生物技術股份有限公司)，第1管加入IgG1-FITC及IgG1-APC同型抗體各10μl，第2管加MPO-FITC單抗(美國BD公司)10μl及CD3-APC單抗5μl，室溫孵育30min，加入2ml PBS洗1次，棄上清，每管加1%多聚甲醛0.5ml，BD FACS cantoⅡ流式細胞儀獲取，數據用FACS Diva軟件分析，陽性MPO表達的原始細胞(包括幼稚單核細胞)>10%為MPO表達陽性。

3.統計學方法 ：所有數據采用SPSS 24.0統計學軟件對數據進行統計分析，計數資料多組之間的比較采用χ2檢驗，組間比較采用Bonferroni方法，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.AML患者MPO總體表達分析：AML患者共90例，MPO表達陰性僅見4例，3種方法聯合檢測MPO表達陽性率為95.5%。除AML-M7亞型均呈MPO陰性表達外，MPO陰性患者僅出現在AML-M5亞型(表1)。

表1 AML患者FAB分型及MPO陽性率

2.3種方法檢測AML患者MPO陽性率的比較：90例AML患者骨髓活檢組織、骨髓涂片及骨髓液標本MPO陽性率分別是66.7%(60/90)、93.3%(84/90)及87.8%(79/90)(表1)，陽性率明顯不同，差異有統計學意義(χ2=24.782,P=0.000)。其中，免疫組織化學方法檢測MPO陽性率顯著低于骨髓涂片細胞化學法和流式細胞學方法(P<0.05)，而細胞化學法和流式細胞術檢測MPO陽性率比較,差異無統計學意義(P<0.05)。

3.AML-M5患者MPO表達：除M7(急性巨核細胞白血病外)，MPO共陰性的標本只見于M5患者中，因此，為比較3種方法對原始幼稚單核細胞MPO表達的敏感度，對27例M5患者的MPO表達分析，免疫組化陽性率為37%(10/27)明顯低于細胞化學法(88.9%，24/27)，差異有統計學意義(P<0.05)，免疫組化法低于流式細胞學方法(63.0%，17/27)，但差異無統計學意義(P>0.05)，而細胞化學和流式細胞術檢測MPO結果比較，差異無統計學意義 (P>0.05)。以其中1例M5b患者為例，組化顯示原始及幼稚單核細胞MPO(-)，但骨髓涂片原始及幼稚單核細胞胞質內可見明顯MPO陽性顆粒，免疫學分型顯示MPO陽性率占14.2%(圖1)。

圖1 1例AML-M5b患者酶免疫組織化學、細胞化學及流式細胞學MPO檢測結果比較

討 論

多參數流式細胞學的應用使白血病的免疫學分型更為精確，但MPO仍然是FAB及WHO分型鑒定AML或者急性非淋巴細胞白血病(ANLL)關鍵的參考指標[1]。流式細胞學、免疫組織化學及細胞化學3種方法，任何一種能檢測到白血病細胞MPO表達陽性的結果，都可以認為其具髓系分化特征[2]。上述3種檢測方法相互補充，本研究對90例AML患者的MPO進行檢測，均為陰性結果的標本僅為4例，其中包含1例M7患者，可見通過多種方法對急性白血病骨髓標本MPO的檢測可以鑒定絕大多數急性非淋巴細胞白血病，然而在AML的實驗室診斷實際過程中，上述3種檢測時間并不同步，MPO檢測結果并非完全一致。因此本研究回顧分析了筆者醫院部分初診AML患者MPO表達情況，對上述3種檢測結果進行比較和分析，以利于臨床醫生對檢測報告更好的解讀。

本研究數據表明3種方法對MPO檢測，結果明顯不一致，差異有統計學意義。其中，活檢組織MPO陽性率最低，顯著少于細胞化學及流式細胞學方法檢測MPO的陽性率(P均<0.05)，細胞化學與流式細胞學兩者檢測MPO陽性率最接近(P>0.05)。從FAB分型中各類AML細胞MPO陽性率看，除M0和M7之外，AML-M5患者的MPO陽性率各種方法檢測均最低，各組間差異亦明顯，而以組織化學方法檢測MPO陽性率最低，與細胞化學之間的差異最明顯。相對而言，細胞化學法或流式細胞學方法檢測AML患者MPO敏感度更高。對于多克隆抗體檢測活檢組織白血病細胞MPO敏感度低于細胞化學法和流式細胞學方法的原因，筆者認為，可能在于原始及幼稚單核細胞本身低表達MPO，病理免疫組化涂片對弱或極弱表達的MPO不易分辨，而油鏡下對骨髓涂片MPO陽性顆粒較少的細胞更容易辨認，流式細胞術MPO單克隆抗體檢測通過設門分析有能夠排除背景細胞干擾的優勢。三者檢測原理的區別在于聯苯胺法是對MPO酶活性的鑒定，而多克隆抗體方法對骨髓活檢組織切片或單克隆抗體流式細胞術等免疫學方法檢測胞內MPO，只能反映MPO是否存在，不能反映酶的活性。這樣，理論上會存在對部分患者用3種方法檢測MPO結果不一致的現象[3]。

本研究AML-M0患者共2例，雖然活檢組織及細胞涂片MPO陰性反應，但流式細胞術顯示2例均表達MPO蛋白，足見流式細胞術在白血病分型中的優勢，這或許因為本研究2例M0患者僅存在MPO前體蛋白，而無酶活性有關[3]。除外電子顯微鏡檢測技術，免疫學方法較細胞化學方法更敏感[4]。除AML-M0外，本研究細胞化學染色法與流式細胞學方法檢測MPO相比較，結果較一致，與文獻報告結果相似[5，6]。此外，本研究兩例AML-M5a患者細胞化學檢測MPO陽性而流式細胞術未檢出，或許和兩者陽性率判斷標準有關，大樣本資料更有利于統計學分析。

總之，本研究顯示不同的MPO檢測方法，AML患者MPO陽性檢出率不盡相同，流式細胞術對AML-M0的診斷有不可替代的優勢，細胞化學染色對AML-M5患者MPO的敏感度優于流式細胞術，三者結合可以顯著提高AML患者MPO的檢出率，比單獨一種方法更有助于急性白血病的準確分型。