MiR-449a和PLAGL2在卵巢癌中的表達關系及臨床意義

王秋宇 李曉翔 朱軍義

卵巢癌好發于50～60歲的絕經后女性，在婦科惡性腫瘤排名第三位，是臨床上較為常見的女性生殖器官惡性腫瘤疾病[1,2]。國際癌癥研究中心報道指出，全世界每年有70萬新增卵巢癌患者，其病死率為18.78/10萬，占惡性腫瘤死亡病例的18.09%，2013年全球卵巢癌標化發生率為37.68/10萬，標化病死率為10.18/10萬[3，4]。因此深入探討卵巢癌的發病機制對卵巢癌患者的早期診斷、治療以及提高患者的生存質量具有重要的意義。miRNA與腫瘤的發生、發展、凋亡也有有著密切的聯系。MiR-449a可通過抑制蛋白激酶B信號通路進而抑制腫瘤內皮細胞增殖和集落形成。MiR-449a對免疫系統調控、血管生成和腫瘤轉移等方面發揮著重要作用[5，6]。研究證實MiR-449a基因突變時，表達降低時，腫瘤細胞無限制増殖、血管生成速度加快，且相關細胞因子如VEGF、P53等均表達增高。多形性腺瘤基因鋅指蛋白2(pleomorphic adenoma gene 2，PLAG2)是促癌蛋白，其突變率為3%～11%，當其突變時，腫瘤細胞無限制増殖、血管生成速度加快，PLAG2基因突變在癌癥的早期就會出現，且PLAG2基因狀態不受藥物治療的阻斷[7，8]。目前關于MiR-449a和PLAGL2表達與卵巢癌關系的研究較少，本研究擬檢測MiR-449a和PLAGL2在卵巢癌組織中的表達水平，探討其與臨床病理參數和預后的關系。

資料與方法

1.一般資料：選取2011年1月～2015年2月在筆者醫院婦科行手術治療并經病理證實的卵巢癌患者136例，患者年齡為40～74歲，平均年齡57.5±17.8歲，病程為9個月～4年，其中絕經婦女64例、未絕經婦女72例、未分化癌4例、子宮內膜樣癌6例、透明細胞癌6例、混合型腺癌20例、漿液性腺癌82 例、黏液性腺癌18例。所有患者符合美國國家綜合癌癥網(NCCN)公布的2013版《Ovarian cancer, version 2.2013》中關于卵巢癌的診斷標準[9]。手術切除標本后行病理檢查以判定腫瘤最大徑、病理學分級、TMN分期、浸潤深度、有無淋巴血管間隙浸潤、有無淋巴結轉移。同時取距卵巢癌組織5cm以上的正常卵巢組織為癌旁組。患者自愿提供正常卵巢組織及卵巢癌組織標本，用作分析MiR-449a、PLAGL2蛋白的表達。納入標準：既往無精神障礙史，無心理疾患或精神疾病史；本研究經筆者醫院醫學倫理學委員會審批，所有患者(或患者直系親屬)均簽署知情同意書。排除標準：肝臟、腎臟、心功能異常者，感染性疾病、甲狀腺疾病、入院前接受放射治療化學治療的其他惡性腫瘤、膽汁淤積、自身免疫性疾病。

2.主要儀器和試劑：超凈工作臺(上海恒躍醫療器械有限公司)、MiR-449a、PLAGL2 Elisa試劑盒購自武漢華美生物科技有限公司、熱電MK3酶標儀、MiR-449a、PLAGL2一抗購自上海邦奕生物科技有限公司、免疫組化二抗試劑盒、抗體稀釋液、DAB顯色試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司。

3.ELISA測定MiR-449a、PLAGL2蛋白水平：所有實驗操作均為無菌操作，實驗所有器具高壓滅菌，37℃烘干。將保存在-70℃冰箱中的正常卵巢組織、卵巢癌組織取出解凍。稱取0.5g正常卵巢組織、卵巢癌組織，加入少量液氮，在微波碾磨儀(5000r/s)中迅速將其碾碎至粉末狀；將組織粉末轉入1ml Eppendorf管中，加入0.8ml PBS(pH值為7.4)，充分振蕩混勻，2000×g，4℃，離心20min。仔細收集上清液。獲取正常卵巢組織、卵巢癌組織勻漿后，采用Elisa法檢測正常卵巢組織、卵巢癌組織的MiR-449a、PLAGL2蛋白表達量。

4.MiR-449a、PLAGL2在正常卵巢組織、卵巢癌組織的表達水平的測定：免疫組化法測定MiR-449a、PLAGL2在正常卵巢組織、卵巢癌組織中的表達，制作常規5μm的正常卵巢組織、卵巢癌組織石蠟切片，3%的H2O2液常溫阻斷內源性過氧化氫酶活性，微波修復抗原，PBS常規沖洗，1%的MiR-449a、PLAGL2抗體工作液(稀釋濃度1∶200)購自英國Abcam公司，4℃過夜，加入二抗(IgG)，室溫30min，加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，(50%、60%、80%、90%、95%、100%)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。隨機選取5個高倍視野(×400)計數，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，同時計數；>50% 為(+++)，26%～50%為(++)，6%～25% 為(+)，陽性細胞≤5%為(-)，(-)及(+)歸為不表達組或低表達組即為陰性，(++)及(+++)歸為高表達組即為陽性。

結 果

1.癌旁組、卵巢癌組中MiR-449a、PLAGL2蛋白水平表達：由表1可見，卵巢癌組MiR-449a蛋白表達水平低于癌旁組，PLAGL2蛋白表達水平高于癌旁組(t=113.821、88.774，P<0.01)。

表1 癌旁組、卵巢癌組中MiR-449a、PLAGL2蛋白水平的表達

2.癌旁組、卵巢癌組中MiR-449a、PLAGL2表達的相關性：由表2、圖1可見，卵巢癌組MiR-449a陽性率低于癌旁組、PLAGL2陽性率高于癌旁組(χ2=18.708、151.786，P<0.01)。

表2 不同臨床病理特征組中MiR-449a、PLAGL2表達的相關性分析[n(%)]

圖1 MiR-449a、PLAGL2在癌旁組、卵巢癌組的表達(免疫組化法，×400)

3.MiR-449a、PLAGL2蛋白表達與臨床病理特征的關系：由表3可見，MiR-449a、PLAGL2蛋白表達與年齡相關性不明顯(χ2=0.348、2.429，P>0.05)；與腫瘤最大徑、病理學分級、TMN分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結轉移、復發相關性明顯，且腫瘤最大徑≥5cm、病理學分期越高、TMN分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結轉移、有復發，MiR-449a蛋白陽性表達率越低、PLAGL2蛋白陽性表達率越高(χ2=21.889、17.231、32.026、24.764、49.788、13.782、23.791、15.460、19.436、20.424、17.352、15.631、36.560、23.042，P<0.01)。

表3 MiR-449a、PLAGL2蛋白表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

4.MiR-449a、PLAGL2蛋白表達水平與卵巢癌患者預后分析：由表4及圖2可見，MiR-449a陽性組3年生存率及生存期均明顯高于MiR-449a陰性組,PLAGL2陰性組3年生存率及生存期均明顯高于PLAGL2陽性組(χ2=41.666、37.816、Z=17.980、18.092，P<0.01)。

表4 MiR-449a、PLAGL2蛋白表達水平與卵巢癌患者預后分析

圖2 MiR-449a、PLAGL2陽、陰組生存曲線

討 論

MiR-449a在腫瘤的發生、發展中扮演者重要的角色，MiR-449a在Hedgehog 信號通路扮演著核心調節作用，配體(Shh)未與跨膜蛋白受體(Ptch)結合時，Ptch 抑制跨膜蛋白受體 (Smo)的活化，Smo 被釋放，其下游細胞因子MiR-449a被活化，促進MiR-449a移位到細胞核內，進而抑制下游原癌基因[12]。此外低表達MiR-449a蛋白的腫瘤細胞黏附內皮細胞的能力強，而腫瘤細胞與內皮細胞緊密結，才能穿過細胞外基質層，建立轉移灶[10,11]。體外試驗已證實，MiR-449a能抑制癌細胞增殖，并能強烈促進細胞凋亡，高度表達MiR-449a的乳腺癌細胞株增殖能力明顯低于野生株[12]。本研究中卵巢癌組MiR-449a水平低于癌旁組，卵巢癌組MiR-449a陽性率低于癌旁組，且腫瘤最大徑≥5cm、病理學分期越高、TMN分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結轉移、有復發，MiR-449a表達越低，也與上述討論符合，同時也說明MiR-449a具有抑制癌細胞分化與侵襲遷移能力的作用。本研究同時也發現，MiR-449a陽性組3年生存率及生存期均明顯高于MiR-449a 陰性組，MiR-449a高表達能明顯提高卵巢癌患者預后。

PLAGL2是原癌基因，其結構、功能的異常與遺傳性及散發性腫瘤均相關。近年來國外人群流行病學研究顯示，在乳腺癌的發病過程中，MiR-449a的過度表達會明顯下調PLAG2的表達，進而對乳腺癌細胞的分化及遷移起到抑制作用[13]。此外，PLAGL2在調節人體細胞的復制、遺傳物質DNA損傷修復、細胞的正常生長方面有重要作用。遺傳基因學發現PLAGL2過表達是引發大部分遺傳性腫瘤的主要原因。PLAGL2是Wnt信號通路的重要組成部分，其通過與膜結合鈣黏素結合形成復合體，定位與細胞骨架，維持組織細胞結構的穩定性[14～16]。研究表明，若Wnt信號通路異樣，則PLAGL2過表達，胞質內游離的β-catenin進入胞核，激活下游癌基因(P53、Ras等)，促進癌細胞增殖。本研究中，卵巢癌組PLAGL2水平高于癌旁組，卵巢癌組PLAGL2陽性率高于于癌旁組，這與上述結論一致。研究還發現，IL-8、血管內皮生長因子 (VEGF)由可能由PLAGL2調控，高表達PLAGL2蛋白的腫瘤細胞可分泌更多的IL-8、血管及VEGF，而VEGF、IL-8在供應腫瘤生長的血管系統的形成及實體腫瘤的發展過程中發揮重要作用[17]。

本研究中，腫瘤最大徑≥5cm、病理學分期越高、TMN分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結轉移、有復發，PLAGL2表達越高，也證實了這一點。此外，PLAGL2基因突變一般發生于腫瘤的早期。PLAGL2基因突變后，處于高度活化狀態，且不受EGFR信號通路的調控，即使用EGFR拮抗劑阻斷了上游信號轉導，突變的PLAGL2的仍可發揮其促腫瘤增殖作用， EGFR拮抗劑對PLAGL2基因突變的惡性腫瘤患者不能發揮抗腫瘤作用[18]。本研究中PLAGL陰性組3年生存率及生存期均明顯高于PLAGL 陽性組，推測PLAGL具有促進癌細胞分化與侵襲遷移能力的作用，PLAGL高表達能明顯降低卵巢癌患者預后，與上述討論一致。近期研究表明，PLAGL2蛋白對于腫瘤的發生、發展具有重要的調控作用，其具有時間、空間表達特異性，若藥物抑制PLAGL2蛋白表達，腫瘤細胞的生長得到有效抑制，PLAGL2可能成為腫瘤治療的分子靶點，這有待于進一步研究證實[19]。

綜上所述，MiR-449a在卵巢癌的發生、發展過程中起抑制作用，PLAGL2起促進作用；MiR-449a蛋白在卵巢癌組織中表達量降低，PLAGL2蛋白表達量增加；MiR-449a蛋白高表達的卵巢癌患者能獲得較好的預后，PLAGL2蛋白低表達能獲得較好的預后。