基于HMGB1/TLR4信號通路評價五味子乙素對2型糖尿病腎病大鼠腎臟功能的保護作用

熊 剛 鄒 華 胡承蓮 吳 丹 鄧貴柳

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)為糖尿病中最常見的并發癥之一，也是引起終末期腎病最主要的誘導因素，調查發現約30%患者進一步會惡化為糖尿病腎病階段[1]。DN發病早期主要表現為腎小球濾過能力增高及尿中出現微量白蛋白，如果未能得到及時治療會出現腎小球萎縮、基膜增厚及細胞外基質堆積，進一步引發慢性腎功能不全，直接影響患者的生存質量[2]。倘若對DN疾病發展早期進行及時干預，會改善尿中微量蛋白流出，防止患者進入臨床蛋白尿期。一旦患者疾病惡化為臨床蛋白尿期，患者的腎臟功能將會受到急劇損傷，所以研究DN早期治療的方法具有重大臨床意義[3]。高遷移率族蛋白1(HMGB1)屬于一種核內非組蛋白染色體結合蛋白，可通過與胞膜上Toll樣受體4(TLR4)結合從而激活核轉錄因子-κB(NF-κB)，進一步誘導炎性信號的活化，導致細胞出現炎性反應[4,5]。

五味子乙素(schisandrin B，SchB)是從五味子中提取分離得到的木質素類天然活性化合物，表現出顯著的抗氧化、抗炎癥及抗細胞凋亡的作用，它可以通過抑制細胞內炎性通路活化達到對心臟、大腦、肝臟及腎臟等組織的保護作用[6～8]。目前，SchB對DN大鼠的保護作用及其對HMGB1/TLR4信號通路的相關作用不明確，本研究探討了SchB對DN大鼠腎臟功能及HMGB1/TLR4炎性通路活化的影響，以期為DN早期治療提供新的研究思路。

材料與方法

1.動物及試劑：200～250g雄性SD大鼠40只(遼寧長生生物技術有限公司，實驗動物合格證SCXK2010-0005)，分籠飼養于屏障環境中。五味子乙素(山東綠葉制藥，批號H2011051108，純度≥98%)，鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)；HE染色試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司)；HMGB1(貨號CZ-20170614)、TLR4(貨號ab0252411)、IL-1β(貨號ab1025855)、IL-6(貨號ab1102239)、TNF-α(貨號ab2252172)及β-actin(貨號ab2255027)單克隆抗體購自英國Abcam公司。

2.DN模型構建及藥物治療：采用尾靜脈注射鏈脲佐菌素構建DN模型，3天后檢測大鼠血糖濃度，其中血糖濃度≥16.65mmol/L的大鼠作為實驗組。實驗組動物給予低(15mg/kg)、高(30mg/kg)劑量SchB灌胃，1次/1天，連續4周。正常對照組及DN組大鼠給予同體積生理鹽水灌胃。

3.生化指標檢測：大鼠灌胃4周后，收集各組大鼠24h尿液。采用適量的10%水合氯醛麻醉大鼠后，每只采取3ml，靜置于冰上2h后3000×g離心5min，吸去血清轉移至無菌Ep管內。采用全自動生化分析儀(西門子)測定各組大鼠ALT、Ucr、Scr、Cys-c及Ccr值。

4.HE染色實驗：采血結束后開腹收集大鼠腎臟組織，用生理鹽水反復沖洗至顏色變白，將左側腎臟組織修飾為5mm×5mm×5mm的組織塊，放入4%甲醛中固定，用于HE染色。右側腎臟組織立即放入-80 ℃冰箱用于Western blot法實驗。

5.Western blot法檢測：稱取腎臟組織10mg，在冰上用碾磨器攪碎后4℃、13000×g離心15min，吸取蛋白上清至新Ep管中，采用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定，加入適量上樣緩沖液混勻，100℃煮沸7min。用12%的SDS-PAGE凝膠塊電泳分離蛋白，完成后轉膜。切割不同分子量目的蛋白至對應一抗溶液中(稀釋比均為1∶3000)，4℃震蕩過夜，采用HRP標記的二抗(稀釋比1∶1000)37℃孵育1h，TBST洗膜3次后加入ECL顯影液，采用X光膠片曝光。

結 果

1.五味子乙素對DN大鼠腎臟功能指標的影響：五味子乙素治療對DN大鼠腎功能指標影響結果如表1所示，提示DN組Scr、Cys-c及ALT水平相對于正常對照組顯著升高(P<0.05)，而Ucr、Ccr水平則顯著降低(P<0.05)，實驗大鼠DN模型構建成功。但是經過低、高劑量五味子乙素治療后，大鼠Scr、Cys-c及ALT水平相對于DN組顯著降低(P<0.05)，而Ucr、Ccr水平明顯升高(P<0.05)。

表1 各組大鼠Scr、Ucr、Ccr及Cys-c比較

2.五味子乙素對DN大鼠腎臟組織形態的影響：大鼠腎臟組織形態觀察發現正常對照組腎臟組織結構正常，DN組腎小球有一定程度萎縮，組織結構排列不均勻，并且有腫脹，脫落現象，還存在空泡樣變性，鮑曼囊腔擴；而經過高劑量五味子乙素治療后，可改善上述不良形態,詳見圖1。

圖1 各組間大鼠腎臟組織形態比較(HE染色，×200)

3.五味子乙素對DN大鼠腎臟組織HMGB1/TLR4通路的影響：五味子乙素治療對DN大鼠腎臟組織HMGB1/TLR4通路影響結果如圖2、表2所示，提示DN組HMGB1、TLR4蛋白表達水平相對于正常對照組顯著升高(P<0.05)，而經過低、高劑量五味子乙素治療后，大鼠腎臟組織HMGB1、TLR4蛋白表達水平相對于DN組顯著降低(P<0.05)。

圖2 各組間大鼠腎臟組織HMGB1、TLR4蛋白表達比較

表2 HMGB1、TLR4蛋白表達水平

4.五味子乙素對DN大鼠腎臟組織炎性因子的影響：如圖3、表3所示，DN組IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表達水平相對于正常對照組顯著升高(P<0.05)，而經過低、高劑量五味子乙素治療后，大鼠腎臟組織IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表達水平相對于DN組顯著降低(P<0.05)。

圖3 各組間大鼠腎臟組織炎性蛋白表達比較

表3 IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表達水平

討 論

糖尿病屬于一種常見的內分泌代謝紊亂性疾病，然而DN為糖尿病較為常見的并發癥之一，最后也許惡化為慢性腎功能不全及終末期腎衰竭，會給患者及家庭帶來極大的影響[9]。DN主要為血糖急劇升高外，還常伴隨著蛋白質及脂肪等代謝異常及腎臟組織病變[10]。五味子常用于滋補的中藥，性味溫和，對人體心臟、肝臟、脾臟、肺及腎臟起著平衡作用，還屬于補益類及鎮靜類中藥，然而對其成分提取發現木質素的藥理活性最強，其中SchB是最主要的活性化合物之一。已有研究發現SchB能通過抑制TGF-β/Smad信號轉導起到抗腎纖維化的作用[11]。原麗欣[12]研究發現SchB可通過增強SOD及GSH-Px等抗氧化酶活性，改善活性氧(ROS)所致腎組織的氧化損傷。但是SchB對糖尿病所致腎病的保護作用尚未見相關研究。本研究采用尾靜脈注射鏈脲佐菌素構建DN模型，發現大鼠Scr、Cys-c及ALT水平顯著升高，而Ucr、Ccr水平顯著降低，說明DN組大鼠腎臟功能受到嚴重損傷。通過給予低、高劑量SchB治療4周后，上述生物學指標均得到明顯改善，并且腎臟組織形態也得到部分改善，由此提示SchB對糖尿病所致腎病大鼠的腎臟功能具有改善作用。

在DN發病過程中，疾病早期腎小球及間質會出現巨噬細胞及T細胞浸潤，白細胞產生IL-1β、IL-6及TNF-α等促炎性因子，后者進一步誘發腎臟細胞產生多種趨化因子，引發新一輪的炎性反應[13]。HMGB1能與細胞膜上TLR2及TLR4受體相互作用，活化細胞內炎性通路，誘發炎性因子的大量產生。早期發現糖尿病患者TLR4表達量顯著增高，能誘導下游分子NF-κB轉入細胞核內，促使炎性基因的轉錄，進一步導致腎臟受損[14]。糖尿病患者常出現肥胖、胰島素抵抗及氧化應激增強等病癥，還發現存在熱休克蛋白60及游離脂肪酸的含量升高，從而活化TLR4/NF-κB炎性轉導信號，誘導大量細胞因子及炎性介質的產生，導致炎性損傷[15～17]。由于TLR4介導下胞內各信號轉導相互作用，共同加劇ND疾病的發生、發展。

本研究中低、高劑量SchB組與DN組大鼠比較，HMGB1及TLR4蛋白表達量顯著降低。前期研究發現，SchB可通過抑制TLR4/NF-κB/MyD88信號通路活化進而降低神經炎性反應及改善膿毒癥，說明SchB可以下調TLR4蛋白表達[18]。然而SchB對HMGB1蛋白表達的報道較少，本文結果提示SchB同樣可以降低HMGB1蛋白表達，進一步抑制其下游基因TLR4的活化，但是SchB是否可以直接作用于HMGB1蛋白尚需進一步研究。研究還發現SchB可誘導炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表達量的降低，HE染色發現SchB對腎臟組織具有保護作用，提示SchB可能通過抑制腎臟HMGB1及TLR4的表達進而抑制炎性通路的活化，降低細胞因子和炎性介質的產生，發揮對DN大鼠腎臟的治療作用，然而SchB對炎性轉導信號通路的影響機制還有待于深入探討。