TMEFF2啟動(dòng)子甲基化對(duì)膀胱癌增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

張文濤，張子威，毛士玉，郭亞東，張俊峰，王龍圣，吳 元，姚旭東

膀胱癌(bladder cance，Bca)是男性常見的泌尿系腫瘤之一，在中國(guó)，2015年Bca新發(fā)病例約8萬[1-2]。非肌層浸潤(rùn)性Bca大約占Bca的75%，而肌層浸潤(rùn)性Bca約占25%。因此，發(fā)現(xiàn)和篩選新的腫瘤生物標(biāo)志物對(duì)于Bca的預(yù)防、診斷和治療具有重要意義。

研究[3]表明表觀遺傳學(xué)改變可以影響基因的表達(dá)，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。含表皮樣生長(zhǎng)因子和卵泡抑素結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋2(transmembrane protein with EGF and two follistatin motifs 2, TMEFF2)也稱為增生性息肉病1，具有表皮生長(zhǎng)因子樣的跨膜蛋白和兩個(gè)卵泡抑素樣結(jié)構(gòu)域。目前研究[4-5]證實(shí)，TMEFF2在前列腺癌、乳腺癌、肺癌中啟動(dòng)子高甲基化。而在Bca中，TMEFF2是否參與Bca的發(fā)生發(fā)展，其具體機(jī)制仍不明確。該文采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Bca患者尿液中TMEFF2基因的甲基化情況，并研究去甲基化對(duì)Bca生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1MethHC數(shù)據(jù)庫基因甲基化與表達(dá)(DNA methylation and gene expression in Human Cancer, MethHC)數(shù)據(jù)庫是基于腫瘤基因組圖譜(the cancegenome atlas， TCGA)公共數(shù)據(jù)庫，關(guān)注腫瘤基因表達(dá)和DNA甲基化的綜合數(shù)據(jù)庫，其中包括超過6 000個(gè)樣本的18個(gè)人類癌癥和6 548個(gè)芯片和12 567個(gè)RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。在MethHC數(shù)據(jù)庫中，選擇“膀胱癌(bladder cancer, BLCA)”，在“gene search”中輸入“TMEFF2”,在“gene region”中選擇“promoter”(https://methhc.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)。

1.2病例資料收集2017年1月～2017年8月間，在同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院20例Bca患者尿液及10例正常尿液標(biāo)本。Bca患者尿液標(biāo)本在手術(shù)前3 d 收集，將新鮮組織樣本立即在液氮中快速冷凍并儲(chǔ)存在-80 ℃直至進(jìn)一步使用。30例標(biāo)本在年齡、性別等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該研究經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者或其直系親屬的知情同意。 該項(xiàng)工作也符合世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)的道德準(zhǔn)則(赫爾辛基宣言)。

1.3主要材料人正常膀胱上皮細(xì)胞(SV-HUC-1)、人膀胱移行癌細(xì)胞株(T24,UMUC3，EJ，5637)均購(gòu)自上海細(xì)胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；甲基化酶抑制劑5-氮雜-2′脫氧胞苷(5-aza-2′ deoxycytidine，5-Aza-dc)，CCK-8試劑盒購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；甲基化特異熒光PCR試劑盒購(gòu)自上海紐思格生物醫(yī)學(xué)科技有限公司；兔抗人TMEFF2抗體、Bcl2抗體和Bax抗體、羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；預(yù)涂有Matrigel的Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Costar公司。

1.4主要方法

1.4.1患者尿液甲基化特異性熒光PCR 取5～50 ml尿液，3 000 r/min離心10 min，棄上清液，留沉淀用于DNA提取。采用磁珠法自動(dòng)核酸提取儀進(jìn)行核酸提取，經(jīng)裂解與亞硫酸氫鹽的轉(zhuǎn)化反應(yīng)并純化。采用甲基化特異的實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：50 ℃、2 min，95 ℃、5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、40 s，循環(huán)40～45次。TMEFF2基因引物序列為F：5′-TTTGCCAGTTTGGTGCAGAA-3′；R：5′-GATTGAAG TTGGTTTGAGAACAGTCA-3′；P：5′-FAM-ACGAAGA TGCCGAGGATGTCTGGTGT-MGB-3′。內(nèi)參ACTB引物序列為 F：5′-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAA GT-3′；R：5′-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′；P：5′-FAM-ACCACCACCCAACACACAATAAC AAACACA-MGB-3′。獲得TMEFF2和ACTB的擴(kuò)增曲線和熒光域循環(huán)次數(shù)(cycle threshold, CT值)。見圖1B。利用ΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量的計(jì)算。

1.4.2膀胱癌T24細(xì)胞培養(yǎng)及5-Aza-dc處理 在含10%胎牛血清、含有雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)、傳代并在6孔板上鋪板。 當(dāng)6孔板上細(xì)胞生長(zhǎng)至70～80%時(shí)在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中分別加入含5-Aza-dc的培養(yǎng)基，使其藥物終濃度分別為5、10 μmol/L，對(duì)照組加入同體積的DMSO，細(xì)胞經(jīng)5-Aza-dc連續(xù)處理3 d，每天更換新鮮配置的藥物。

1.4.3膀胱癌T24細(xì)胞轉(zhuǎn)染 常規(guī)培養(yǎng)T24細(xì)胞，傳代并在6孔板上鋪板。 當(dāng)6孔板上細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～ 90%時(shí)，按照Invitrogen公司的Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染TMEFF2質(zhì)粒(Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司)，對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒。

1.4.4Western blot檢測(cè) 每孔加入40 μg蛋白樣品，用10%SDS-PAGE濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，同時(shí)用5%脫脂奶粉稀釋一 抗(兔抗人TMEFF2、Bcl2和Bax抗體)，4 ℃過夜；加入羊抗兔二抗，室溫孵育2 h， 顯影。

1.4.5CCK-8實(shí)驗(yàn) 使用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖速率。 將細(xì)胞以1×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中，并用5-Aza-dc加藥5 d。向每個(gè)孔中加入10 μl CCK-8試劑，將細(xì)胞在37 ℃下保持2 h。 使用微孔板分光光度計(jì)測(cè)量450 nm處的吸光度(optical density，OD)值。

1.4.6細(xì)胞劃痕遷移試驗(yàn) 在6孔板上每孔的左、中、右用20 μl槍頭在水平垂直方向各劃一條線。 用PBS洗細(xì)胞去除劃下的細(xì)胞。 將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基以觀察其遷移能力。拍照記錄0、24、48 h細(xì)胞的遷移能力。

1.4.7Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 使用預(yù)涂有Matrigel的Transwell小室測(cè)量細(xì)胞侵襲能力。將5×104個(gè)加藥細(xì)胞接種到不含F(xiàn)BS的RPMI-1640培養(yǎng)基(200 μl)中的每個(gè)24孔板中，并將600 μl含有10%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基加入到底部室中。將細(xì)胞在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。 16 h后，Transwell小室用冷PBS洗滌3次，上層小室中未遷移的細(xì)胞用濕棉簽仔細(xì)擦拭，而過濾器另一側(cè)的侵襲穿過的細(xì)胞，用70%乙醇處理30 min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10 min。在顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲。

2 結(jié)果

2.1TMEFF2在MethHC數(shù)據(jù)庫中甲基化表達(dá)情況在MethHC中，利用該網(wǎng)站中提供的TCGA數(shù)據(jù)庫來源的432個(gè)膀胱樣本，其中正常膀胱組織28例，膀胱腫瘤404例。 按上述條件搜索， TMEFF2有一個(gè)轉(zhuǎn)錄本NM_016192，其在Bca組織中甲基化水平明顯高于正常組織(P<0.05)。見圖1A。

2.2TMEFF2在人尿液甲基化水平增高檢測(cè)的30例尿液樣本中，20例為Bca患者，10例為正常人，對(duì)于TMEFF2甲基化水平，在Bca患者尿液中，16例發(fā)生高甲基化(80%)，而在正常人尿液中僅有2例發(fā)生高甲基化(20%)。使用Fisher確切概率法統(tǒng)計(jì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.656，P<0.05)。見圖1B、1C。

2.3TMEFF2蛋白在不同Bca細(xì)胞株中的表達(dá)降低Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SV-HUC-1細(xì)胞株相比，TMEFF2蛋白在T24、UMUC3、EJ、5637細(xì)胞株中表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=712.6，P<0.05)。見圖1D。因此本實(shí)驗(yàn)選擇T24細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。

2.45-Aza-dc處理轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后TMEFF2蛋白表達(dá)明顯增加5-Aza-dc處理后T24細(xì)胞TMEFF2蛋白表達(dá)量較未處理組表達(dá)量明顯增加。當(dāng)5-Aza-dc濃度為10 μmol/L時(shí)，TMEFF2表達(dá)量相對(duì)較高(F=286.6，P<0.05)，見圖2A；因此，選擇10 μmol/L為后續(xù)實(shí)驗(yàn)組的濃度。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TMEFF2+組細(xì)胞中蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(t=90.9,P<0.05)。見圖2B。

圖1 TMEFF2基因和甲基化表達(dá)情況

圖2 5-Aza-dc處理和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后TMEFF2蛋白表達(dá)情況

2.55-Aza-dc降低T24細(xì)胞增殖能力情況CCK-8檢測(cè)5-Aza-dc處理前后T24細(xì)胞增殖能力情況，分別檢測(cè)6、12、24、36、48 h的OD值，結(jié)果顯示，5-Aza-dc處理組T24細(xì)胞在48 h的OD值較對(duì)照組顯著降低，兩組OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.88,P<0.05)。見圖3A。同時(shí)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TMEFF2+組T24細(xì)胞在48 h的OD值較對(duì)照組也顯著降低，兩組OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.815,P<0.05)，見圖3B。

2.65-Aza-dc降低T24細(xì)胞遷移和侵襲為評(píng)估5-Aza-dc對(duì)Bca細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，首先，對(duì)T24細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞劃痕試驗(yàn)。與對(duì)照組相比，處理組Bca細(xì)胞的遷移的能力顯著降低。此外，通過預(yù)先涂有Matrigel的transwell小室也證明5-Aza-dc顯著降低了T24細(xì)胞的侵襲性。見圖4A、4B。同時(shí)通過高表達(dá)TMEFF2基因也證明其干擾了Bca細(xì)胞的遷移和侵襲。

2.75-Aza-dc促進(jìn)T24細(xì)胞凋亡5-Aza-dc處理48 h后，提取T24細(xì)胞系蛋白，通過Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)的蛋白，可以發(fā)現(xiàn)相較于對(duì)照組，B淋巴細(xì)胞瘤-2基因 (B-cell lymphoma-2,Bcl-2)明顯下降，而Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 assaciated X,Bax)顯著上升，Bcl-2和Bax與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.21,P<0.05；t=20.45,P<0.05)，由此可以證明5-Aza-dc可以促進(jìn)Bca細(xì)胞的凋亡。在高表達(dá)質(zhì)粒中，Western blot同樣證明了TMEFF2促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，Bcl-2和Bax與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.87,P<0.05；t=20.66,P<0.05 )。見圖4C。

圖3 5-Aza-dc處理和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后TMEFF2后細(xì)胞增殖能力降低

圖4 5-Aza-dc處理和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后TMEFF2后對(duì)膀胱癌遷移侵襲和凋亡的影響

3 討論

通過檢測(cè)30例尿液樣本，Bca細(xì)胞系以及數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證了TMEFF2在Bca中低表達(dá)，并證明其甲基化水平高表達(dá)。利用去甲基化藥物5-Aza-dc誘導(dǎo)TMEFF2高甲基化狀態(tài)的Bca細(xì)胞去甲基化，當(dāng)5-Aza-dc濃度為10 μmol/L，通過Western blot實(shí)驗(yàn)、CCK-8實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5-Aza-dc處理前后T24細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)行為的變化，表明5-Aza-dc處理后TMEFF2表達(dá)水平升高，甲基化水平得到逆轉(zhuǎn)，并抑制了Bca的增殖、遷移、侵襲并促進(jìn)凋亡。同時(shí)，通過高表達(dá)TMEFF2也證明該基因能干擾Bca的相關(guān)生物學(xué)行為，進(jìn)一步證明該基因在Bca發(fā)揮重要作用，并且高甲基化水平可能是其發(fā)揮作用的重要原因。

自2001年首次發(fā)現(xiàn)TMEFF2存在差異甲基化序列之后，目前已經(jīng)在許多癌癥中揭示TMEFF2的啟動(dòng)子處于高甲基化水平[6]。Sun et al[7]通過基因集富集分析和基因本體富集分析證實(shí)在胃癌中TMEFF2改變、細(xì)胞增殖、凋亡和DNA修復(fù)途徑顯著富集。Herbst et al[8]在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)TMEFF2的甲基化與預(yù)后不良相關(guān)，也有研究[9]證實(shí)，通過其CpG島(CpG island)的甲基化，導(dǎo)致基因的表觀遺傳沉默，從而抑制癌細(xì)胞的凋亡。而在Bca中，Monteiro-Reis et al[10]研究了TMEFF2甲基化水平的表達(dá)情況，然而對(duì)其具體機(jī)制在Bca中仍無深入研究。因此在本文中，當(dāng)應(yīng)用去甲基化藥物后，干擾了Bca細(xì)胞系的增殖、遷移、侵襲和凋亡。這些研究也為探討B(tài)ca發(fā)生機(jī)制提供新的方向。

DNA的表觀遺傳改變可以調(diào)節(jié)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)。DNA甲基化是DNA的表觀遺傳改變調(diào)節(jié)基因表達(dá)的常見機(jī)制。在許多基因的啟動(dòng)子區(qū)周圍，存在許多以CpG二核苷酸成簇形成CpG島。在許多人類惡性腫瘤中，CpG島的高甲基化抑制腫瘤抑制基因的表達(dá)，即表觀遺傳沉默[11]。近年來研究[12]表明，在腫瘤發(fā)生的早期DNA的異常甲基化比基因突變更為頻繁，因此與正常人相比，腫瘤患者中甲基化的基因可能是潛在的生物標(biāo)志物。膀胱是作為尿液的暫時(shí)儲(chǔ)存的器官，其尿液中基因甲基化水平可能更能反映膀胱的狀態(tài)。Jarmalaite et al[13]報(bào)道了通過檢測(cè)一組基因的甲基化水平，來預(yù)測(cè)淺表Bca是否會(huì)進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性Bca。并證實(shí)啟動(dòng)子甲基化作為Bca疾病進(jìn)展期預(yù)后的有價(jià)值生物標(biāo)志物的分析。在Bca中，Costa et al[14]報(bào)道了通過檢測(cè)尿液中一組包括TMEFF2基因的甲基化水平來診斷Bca，其敏感性達(dá)到94%、特異性達(dá)到90%, 然而該項(xiàng)研究樣本量并不大，并且未對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入研究。因此，TMEFF2在Bca中甲基化是否可以作為一個(gè)潛在的診斷性標(biāo)志物，還需要更多的臨床樣本進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究從大數(shù)據(jù)庫水平、尿液水平、細(xì)胞系水平驗(yàn)證了Bca中TMEFF2基因甲基化的變化，并影響了其生物學(xué)行為，表明Bca的發(fā)生發(fā)展可能受表觀遺傳影響。當(dāng)然本研究的不足之處有：① 未能在更大尿液樣本中驗(yàn)證。② 未能在Bca組織中驗(yàn)證其表達(dá)情況。③ 未能對(duì)收集標(biāo)本進(jìn)行隨訪研究。因此，在接下來的研究中希望開展大樣本多中心的研究，并希望將該基因尿液的甲基化檢測(cè)應(yīng)用在Bca的早期篩查中。