情景記憶及恐懼記憶消退與再次建立的關聯性

姚慧慧， 張平平, 王烈成

學習記憶是中樞神經系統的一項重要的高級生命活動。巴甫洛夫經典條件反射模型以及在此基礎上發展出來的情景條件反射是最常用來研究動物恐懼記憶的動物模型。將聲、光等中性刺激與厭惡性足部電擊非條件化刺激(unconditioned stimulus, US)配對呈現。兩種刺激重復配對，使條件化刺激獲得抑價，條件化個體形成聯合性記憶，稱為條件化刺激(conditioned stimulus, CS)，使有著對US的厭惡性恐懼的個體對后續呈現的CS或者訓練場景產生恐懼反應。按照CS的來源不同，可以分為線索性恐懼條件化(聲、光、氣味等引起)和場景性恐懼條件化(情景引起)[1-3]。條件化恐懼消退是指條件化恐懼情緒建立之后，僅重復呈現CS而無US，則己建立的恐懼情緒逐漸減弱甚至消失，該過程簡稱恐懼消退[4]。該研究的實驗設計方法可以短時間內進行恐懼記憶的建立與抹除，同時可以觀測到情景記憶在此期間的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物成年昆明正常小鼠 20 只，雄性，體質量18～22 g，月齡、體質量等差異無統計學意義。由安徽醫科大學實驗動物中心提供。實驗動物實行單籠飼養，飲食自由，飼養溫度在25 ℃左右，保持環境干燥通風。

1.2方法

1.2.1非條件刺激的最佳刺激持續時間與刺激強度探索 非條件刺激由連續兩次相同的足底電擊組成，兩次電擊的間隔時間為2 s。探索條件：0.04 mA，持續8 s；0.05 mA，持續6 s；0.06 mA，持續4 s。通過 ZH-KJ型場景恐懼實驗系統(安徽正華生物儀器設備有限公司)檢測小鼠在不同刺激強度與時間組合下的木僵行為，從而確定最佳刺激強度與時間。然后探索最佳條件刺激：使用三種頻率(1、1.5、2 kHz)的鈴聲(聲壓為75 dB，時長30 s)分別與非條件刺激配對，重復5次(每組條件刺激與非條件刺激的間隔時間為3 s)，觀測條件刺激建立的難易程度，從而選擇一種最佳鈴聲作為條件刺激。實驗前先將小鼠放入實驗環境中讓其自由活動以適應環境10 min，小鼠被放進去之前要用70%乙醇進行消毒以消除前一只小鼠氣味的影響。

1.2.2恐懼記憶的建立 將小鼠放入方形籠中，給予其30 s由最佳背景鈴聲作為條件刺激，非條件刺激緊隨其后(間隔3 s的重復5次刺激，每次刺激持續時間3 s)。該聯合刺激每隔5 min給予1次，共給予10次。小鼠出現的木僵反應通過紅外光探測系統進行監測，當小鼠在2 s內沒有發生移動則被認定為出現了木僵行為，用木僵時間來量化。統計分析每次刺激過程中小鼠的木僵時間 。

1.2.3不改變周邊環境條件下恐懼記憶的抹除 在方形籠中小鼠建立恐懼記憶后，只給予條件刺激30 s，不伴有非條件刺激，條件刺激的間隔時間為60 s，總共進行10～20次的條件刺激。觀察記錄每次條件刺激中小鼠出現的木僵時間，統計分析木僵時間變化規律，直至小鼠的木僵現象消失。

1.2.4改變周邊環境條件下恐懼記憶的抹除 將在方形籠中建立恐懼記憶的小鼠放入圓柱體籠中，只給予條件刺激30 s，不伴有非條件刺激，條件刺激的間隔時間為60 s，總共進行10～20次的條件刺激。觀察記錄每次條件刺激中小鼠出現的木僵時間，統計分析木僵時間變化規律，直至小鼠的木僵現象消失。

1.2.5不改變周邊環境條件下恐懼記憶的再次建立 將1.2.3 不改變周邊環境條件下恐懼記憶的抹除中已抹除恐懼記憶的小鼠再次按照1.2.2 恐懼記憶建立的條件進行實驗觀察，記錄統計分析每次刺激過程中小鼠的木僵時間 。

1.2.6實驗流程圖 見圖1。

2 結果

2.1恐懼記憶最佳實驗條件的確定首先探索最佳非條件刺激，主要是通過不斷調整足底電擊的強度與電擊時間的組合。本實驗中主要涉及三種組合非條件刺激(0.04 mA，持續8 s；0.05 mA，持續6 s；0.06 mA，持續4 s)。統計結果(圖2A)可以看出經第二種非條件刺激(0.05 mA，持續6 s)的小鼠在第三次刺激以后，小鼠僵立次數明顯高于其他組合，且隨著電刺激次數的增加這種差別越明顯。以非條件刺激(0.05 mA，持續6 s)為基礎與條件刺激進行配對，此時主要通過改變條件刺激中的聲音頻率(1、1.5、2 kHz)來確定最佳條件刺激。統計結果(圖2B)可以看出，當聲音頻率為1.5 kHz時，小鼠的恐懼記憶更容易形成。因此，最終本實驗采取的最佳實驗刺激條件，其中非條件刺激為0.05 mA足底電擊和持續時間6 s；條件刺激為75 dB鈴聲，頻率1.5kHz，持續時間30 s。

圖1 實驗流程圖

圖2 最佳非條件刺激和條件刺激參數的實驗統計結果

2.2恐懼記憶的形成與鞏固給予小鼠條件刺激與非條件刺激的聯合，這些小鼠第1次 聲音刺激僵立的時間和次數分別為(0.29 ± 0.25) s和(0.25 ± 0.22)次，并隨訓練次數增加而逐步遞增，至第6次分別為(8.90 ± 2.54) s和(2.00 ± 0.50)次，明顯高于第1次條件刺激(P<0.05)，說明恐懼記憶形成，同時隨著第3次以后的訓練此種恐懼記憶逐漸被鞏固。見圖3。

圖3 恐懼記憶的形成與鞏固的實驗統計結果

2.3不改變周邊環境，恐懼記憶的抹除過程在已形成恐懼記憶的小鼠，不改變周邊環境，僅給予條件性聲音刺激，第1次 聲音刺激僵立的時間和次數分別(27.94 ± 1.16) s和(8.75 ± 0.22)次，并隨消退訓練次數增加而逐步遞減，至第3和第4次分別為(20.05 ± 2.26) s和(3.5 ± 0.75)次，顯著性低于第1次條件刺激(P<0.05)，說明恐懼記憶逐漸被抹除。見圖4。

圖4 不改變周邊環境下恐懼記憶的抹除的實驗統計結果

2.4改變周邊環境，恐懼記憶的抹除過程在已形成恐懼記憶的小鼠，改變周邊環境，僅給予條件性聲音刺激，第1次 聲音刺激僵立的時間和次數分別為(24.55 ± 4.03) s和(6.75 ± 0.74)次，并隨消退訓練次數增加而逐步遞減，至第3和第4次分別為(12.85 ± 2.44)s和(4.00 ± 0.61)次，明顯低于第1次條件刺激(P<0.05)，說明恐懼記憶逐漸被抹除。見圖5。

2.5不改變周邊環境下恐懼記憶的再次建立過程小鼠在已形成恐懼記憶后，并如結果2.2抹除其恐懼記憶。在相同的環境下在給予小鼠條件刺激與非條件刺激的聯合，這些小鼠第1次 聲音刺激僵立的時間和次數分別為(0.28 ± 0.24) s和(0.25 ± 0.22)次，并隨訓練次數增加而逐步遞增，至第3次分別為(2.59 ± 0.46) s和(1.5 ± 0.25)次，明顯高于第1次條件刺激(P<0.05)，說明恐懼記憶再次形成。見圖6。

圖5 改變周邊環境下恐懼記憶抹除的實驗統計結果

圖6 不改變周邊環境下恐懼記憶再次形成與鞏固的實驗統計結果

3 討論

3.1對于恐懼記憶條件反射的建立與消除所需時間相對較短作為經典式條件反射行為，眨眼條件反射、恐懼條件反射都是常用的聯合型學習記憶模型，聯合學習指個體對不同時間發生的事件進行聯系并從行為上表達出來。但是一般經典的條件反射過程建立的時間比較久，例如眨眼條件反射。然而作為條件反射的恐懼記憶的建立所需時間相對短得多。通過本實驗的探究方法，小鼠在配對給予 CS與US 的第6次聲音刺激即可成功進行初次恐懼記憶的建立，而不改變周邊環境再次進行恐懼記憶的建立僅需3次聲音刺激。至于恐懼記憶的抹除，不改變周邊環境需要4次聲音刺激，改變周邊環境在第3次聲音刺激時就可以成功抹除。同時，通過小鼠不同的實驗階段的僵立時間的比較也與僵立次數的變化規律相同。

3.2實驗方法便于學生教學，但仍需進一步完善由于學生實驗時間的限制，需短時間內形成條件反射的建立與消退以及觀測情景記憶與條件反射抹除的關聯性，本研究的整個實驗時間可以控制在3 h之內，通過此實驗便于學生理解和解釋臨床中治療患者心理恐懼疾病的原理。但是此實驗探究方法的難點在于：在較短的時間內形成條件反射和條件反射抹除；區分條件反射抹除與情景記憶的關聯性；統計分析實驗中再次建立的條件反射和正常形成條件反射的時間及其差異。

3.3探究情景記憶與恐懼記憶抹除的關聯性行為學研究[5-7]表明，在聯結式學習中情景確實扮演了一定的角色。情景可以作為一個由內部和外部感覺輸入結合的復雜線索，它直接影響到結果的正負性，例如在恐懼條件反射的形成過程。情景不僅有調節作用，而且可以推動線索與結果關聯的檢索，就像以前已經抹除的恐懼反應可以再次更新[ 5, 8]。情景記憶在條件反射中所起到的作用已有報道，但是對于短時間內采用具體的行為學實驗來觀測其在條件反射的建立與抹除過程中的作用未見具體報道。本研究的結果提示，情景記憶在條件反射的抹除過程中起一定的促進作用，即改變生活的周邊環境下，對已經形成的恐懼記憶抹除更加容易。

3.4情景記憶在臨床中對于恐懼記憶抹除的作用通過對情景記憶在恐懼記憶抹除關聯性的認識，有助于理解在臨床治療恐懼記憶或心靈創傷時，醫生經常采取改變患者產生恐懼記憶或心靈創傷的情景，以便更快地幫助患者抹除痛苦的記憶。如學生在校期間受到很嚴重的心靈創傷后的轉學，喪偶后暫時離開居住地以減弱喪偶之痛等。

3.5對于內在的神經機制有待于進一步深入研究對于恐懼記憶的聽覺CSs和情景的獲取和表達，杏仁核起到了重要的作用[9]。從解剖學上講，杏仁核可以分為基底外側杏仁核(BLA)，包括外側(LA)、基底(BA)和副基底(BMA)核，以及中央杏仁核(CEA)，由外側(CEl)和內側(CEm)組成。BLA接收到直接的皮質和丘腦感覺輸入并與許多前腦結構相連接包括內側前額葉皮質(mPFC)和海馬體[9]。CEA投射出下丘腦和中腦結構關于條件恐懼反應的表達[10-11]。海馬不僅可以對情景化信息進行加工，而且對于情景化的恐懼條件反射的行成以及恐懼記憶的線索檢索有著重要意義[ 12-13]。 正是由于中樞神經系統對恐懼記憶有很大的影響，使得恐懼記憶雖然可以短時間內被抹除，但是再次建立很容易。本研究結果表明不改變周邊環境，條件反射的再次建立過程中第3次聲音刺激便能再次建立，與初次建立需要的第6次縮短一半時間。不難看出小鼠的恐懼記憶再次建立非常迅速。這說明條件反射一旦建立，即使由于長時間不加強而遺忘后，再次強化要比首次建立要容易得多，對于此神經機制值得深入研究。