HIF-1α介導(dǎo)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1及其受體表達(dá)的機(jī)制研究

孟承穎，胡德林，余又新，周舜英， 梁 榮，段聲梁，蔣智永，蔣 薇，王 歡，孫業(yè)祥，方林森

血管內(nèi)皮細(xì)胞早期損害主要表現(xiàn)為血管通透性增加，這是血管內(nèi)皮細(xì)胞損害后早期組織水腫、體液外滲的重要病理生理基礎(chǔ)[1]。血管通透性增加引起一系列病理生理改變，如組織器官的缺血低氧、燒傷隱匿性休克等，其中缺血低氧是最早出現(xiàn)的病理生理改變[2]。研究[3]顯示，大量的轉(zhuǎn)錄因子參與低氧條件下細(xì)胞及機(jī)體的各種反應(yīng)，其中低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)被認(rèn)為是最重要的轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1廣泛存在人體的組織和細(xì)胞內(nèi)，是由HIF-1α和HIF-1β組成的異源二聚體，其生物活性主要由HIF-1α亞基決定。HIF-1α亞基是氧調(diào)節(jié)蛋白，被稱為“低氧基因表達(dá)的總開關(guān)”，對氧濃度高度敏感，研究[4]表明，低氧刺激下HIF-1α mRNA的表達(dá)水平可顯著上調(diào)，并增加HIF-1α蛋白的表達(dá)水平和穩(wěn)定活性，隨著氧濃度增加，HIF-1α蛋白會快速降解，而HIF-1β則對氧濃度的敏感性較低，其表達(dá)與低氧與否關(guān)系不明顯。

研究[5]顯示，HIF-1調(diào)控的信號途徑及蛋白表達(dá)可能是造成血管通透性增加的潛在因素。HIF-1介導(dǎo)的相關(guān)基因主要包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管新生基因、內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1)、磷酸果糖激酶等能量代謝基因等，其中介導(dǎo)ET-1及其受體的作用近年來已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌的ET-1是一種縮血管的多肽類物質(zhì)，其產(chǎn)生由多種因素影響。研究[6]顯示，ET-1的分泌受內(nèi)皮細(xì)胞的缺血低氧強(qiáng)烈刺激，并且會進(jìn)一步加重局部和全身循環(huán)的損害。由此可見，HIF-1可能通過介導(dǎo)ET-1的表達(dá)水平而發(fā)揮對低氧應(yīng)激刺激的反應(yīng)。該實(shí)驗(yàn)將通過大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)，建立單層血管內(nèi)皮細(xì)胞模型，運(yùn)用質(zhì)粒過表達(dá)或siRNA干擾技術(shù)建立HIF-1α高表達(dá)和HIF-1α低表達(dá)，應(yīng)用Real-time PCR、Western blot法檢測HIF-1、ET-1、內(nèi)皮素受體A(endothelin receptor A，ETA)、內(nèi)皮素受體B(endothelin receptor B，ETB)的mRNA和蛋白表達(dá)水平，明確HIF-1α在介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中ET-1及其受體表達(dá)中的作用及機(jī)制，為防治創(chuàng)傷后血管通透性增加提供可借鑒的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料TRIzol試劑、PCR試劑盒、DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ECL超敏發(fā)光試劑盒(美國Thermo Fish公司)；引物用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)(由上海生工技術(shù)有限公司合成)；熒光定量PCR試劑、光譜彩虹預(yù)染蛋白Marker、山羊抗小鼠IgG(CW0102)、山羊抗兔IgG(CW0103)、兔抗山羊(CW0105)(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；RIPA細(xì)胞裂解液(強(qiáng))、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、Western blot聚丙烯酰胺凝膠試劑盒、RPMI1640培養(yǎng)基、新生小牛血清、0.2 μm和0.45 μm PVDF膜、GV230質(zhì)粒(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)。根據(jù)GenBank中的HIF-1α(NM_024359)基因編碼序列，參考siRNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成shRNA，利用Ambion公司siRNA在線設(shè)計(jì)軟件分別在3個與HIF-1α無同源性的插入序列形成發(fā)夾，最后為siRNA作用鏈的反向重復(fù)序列。Agel和EcoR I酶切位點(diǎn)在合成的DNA兩端分別引入(上述3條寡核苷酸鏈由上海吉凱基因公司合成)。

1.2方法

1.2.1大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng) 取清潔級SD大鼠主動脈放入D-Hanks液中，清洗干凈暴露的內(nèi)膜面。用含0.1%膠原酶溶液使血管內(nèi)皮細(xì)胞離散下來，然后酶的作用被等量的含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液終止。收集消化后的酶溶液離心，棄上清液，留取內(nèi)皮細(xì)胞懸浮液。用RPMI1640培養(yǎng)液在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，3～4 d更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長至80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，3～5代細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.2.2.1GV230質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞 過表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為三組：空白組、GV230組、GV230/HIF-1α組。轉(zhuǎn)染前將PCR擴(kuò)增后的大鼠HIF-1α基因與GV230質(zhì)粒載體連接形成重組質(zhì)粒，提取并鑒定，形成HIF-1α高表達(dá)細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染的具體操作為：分別將20 pmol的HIF-1α真核表達(dá)載體溶解于終體積為50 μl的cDNA Transfection中渦旋5 s和2.6 μl轉(zhuǎn)染試劑稀釋到終體積為50 μl的cDNA Transfection Buffer中渦旋10 s。將稀釋好的轉(zhuǎn)染試劑加入到核酸溶液中，渦旋3 s，室溫孵育15 min。900 μl培養(yǎng)基加入上述復(fù)合物中，吹打混勻。吸棄原有細(xì)胞培養(yǎng)基，用無菌PBS洗滌細(xì)胞3次，然后加入上述混合好的培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后更換為含篩選抗生素的培養(yǎng)基。

1.2.2.2GV248質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞 siRNA干擾實(shí)驗(yàn)分為：空白組、shRNA-NC組、shRNA/HIF-1α組(包括1、2、3個干擾序列)。轉(zhuǎn)染前需要首先設(shè)計(jì)和合成shRNA，連接shRNA與質(zhì)粒GV248，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選出有效的重組質(zhì)粒，形成HIF-1α低表達(dá)細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染的具體操作與1.2.3.1相同。

1.2.3Real-time PCR 檢測過程 應(yīng)用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，以總RNA為模板合成cDNA第一鏈；以cDNA為模板，使用ABI7500 Real-time PCR儀檢測各組細(xì)胞HIF-1α、ET-1、ETA、ETB的基因表達(dá)。Real-time PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，5 s；60 ℃，34 s，設(shè)置循環(huán)數(shù)為40。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法比較分析各基因表達(dá)，引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

1.2.4Western blot檢測 采用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA法進(jìn)行各組總蛋白定量，按50 μg/孔的量加樣、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。然后，參考說明書進(jìn)行一抗孵育、二抗孵育，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。相應(yīng)二抗室溫孵育1.5 h，3次TBST洗膜，每次10 min。最后，使ECL試劑盒在PVDF膜上顯色曝光。采用Quantity one灰度分析軟件分析目的蛋白灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算其相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 5.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用描述數(shù)據(jù)的集中趨勢，應(yīng)用單因素的方差分析比較多組之間均數(shù)的差異，各組之間的兩兩比較采用LSD法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠血管內(nèi)皮原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果圖1為大鼠血管內(nèi)皮原代細(xì)胞培養(yǎng)1～4 d的結(jié)果。鏡下可見細(xì)胞向四周伸出細(xì)長的突起，部分細(xì)胞間出現(xiàn)連接，細(xì)胞呈現(xiàn)“多角形”，細(xì)胞核呈橢圓狀。

2.2HIF-1α的過表達(dá)及干擾效果分析HIF-1α過表達(dá)后，空白組、GV230組、GV230/HIF-1α組之間HIF-1α的mRNA(F=11.983,P=0.003)和蛋白表達(dá)水平(F=23.015,P<0.001)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LSD兩兩比較結(jié)果顯示，GV230/HIF-1α組的HIF-1α的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于空白組和GV230組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而空白組和GV230組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。反之，siRNA干擾后空白組、shRNA-NC組、shRNA/HIF-1α組之間HIF-1α的mRNA(F=31.992,P<0.001)和蛋白表達(dá)水平(F=10.850,P=0.004)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。shRNA/HIF-1α組的HIF-1α的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于空白組和shRNA-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而空白組和shRNA-NC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖1 大鼠血管內(nèi)皮原代細(xì)胞培養(yǎng)1～4 d的結(jié)果 ×400

2.3HIF-1α介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1及其受體表達(dá)分析與空白組和GV230組相比，GV230/HIF-1α組的細(xì)胞中ET-1、ETA、ETB mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而空白組和GV230組相比ET-1、ETA、ETB mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。反之，與空白組和shRNA-NC組相比，shRNA/HIF-1α組的細(xì)胞中ET-1、ETA、ETB mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而空白組和shRNA-NC組相比ET-1、ETA、ETB mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2、圖3。

3 討論

本研究主要證實(shí)了HIF-1α可介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中ET-1、ETA、ETB mRNA和蛋白表達(dá)水平，即轉(zhuǎn)載HIF-1α高表達(dá)質(zhì)粒的血管內(nèi)皮細(xì)胞中ET-1、ETA、ETB mRNA和蛋白表達(dá)水平都顯著增加，反之轉(zhuǎn)載HIF-1α低表達(dá)質(zhì)粒的血管內(nèi)皮細(xì)胞中ET-1、ETA、ETB mRNA和蛋白表達(dá)水平都顯著降低。本研究結(jié)果提示HIF-1α/ET-1可能是人體內(nèi)組織細(xì)胞低氧條件下的一個重要調(diào)節(jié)通路，參與調(diào)節(jié)人體許多重要的生理過程。

HIF被認(rèn)為是介導(dǎo)機(jī)體低氧反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，可以對機(jī)體低氧狀態(tài)進(jìn)行適應(yīng)調(diào)節(jié)，調(diào)控低氧反應(yīng)基因的表達(dá)。HIF主要在低氧環(huán)境下活化，同時(shí)在富氧環(huán)境下降解。低氧刺激下，HIF-1α與HIF-1β以二聚體的形式在細(xì)胞核內(nèi)與目的基因的某個結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這是低氧應(yīng)激反應(yīng)的最重要的一個環(huán)節(jié)[7]。

ET-1是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的內(nèi)源性血管收縮肽，是HIF-1α下游靶基因。研究[8]顯示，ET-1啟動子區(qū)域存在HIF-1的結(jié)合位點(diǎn)，在低氧環(huán)境下與HIF-1α特異性結(jié)合，激活內(nèi)皮細(xì)胞ET-1，使ET-1表達(dá)增加，從而會進(jìn)一步激活ETA和ETB受體，可能會導(dǎo)致細(xì)胞和線粒體內(nèi)的鈣超載，鈣超載會導(dǎo)致細(xì)胞膜上的G蛋白磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP升高，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。同時(shí)，ET-1濃度升高造成血管進(jìn)一步收縮，這會導(dǎo)致機(jī)體缺血低氧加重，進(jìn)而形成級聯(lián)反應(yīng)造成機(jī)體損傷加重[9-11]。

表2 HIF-1α介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞ET-1及其受體mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平

圖2 HIF-1α的過表達(dá)及干擾后內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)水平

HIF-1α/ET-1通路在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要生理病理作用。研究[12]顯示，燒傷會損害血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起血管通透性改變，這是燒傷早期組織水腫、體液外滲的重要病理生理基礎(chǔ)。在燒傷的過程中，內(nèi)皮細(xì)胞會出現(xiàn)嚴(yán)重的缺血低氧，在低氧應(yīng)激下HIF-1α/ET-1的表達(dá)顯著增高，ET-1引起血管進(jìn)一步收縮，進(jìn)而加重局部和全身循環(huán)的損害[8]。研究[13]表明，糖尿病妊娠患者胎盤組織HIF-1α/ET-1表達(dá)參與了妊娠結(jié)局的發(fā)生、發(fā)展，臨床治療中應(yīng)關(guān)注以HIF-1α/ET-1為靶點(diǎn)的抗糖尿病并發(fā)癥治療，積極改善預(yù)后。妊娠期糖尿病患者由于血糖升高導(dǎo)致胎盤血管病變，滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常及絨毛間質(zhì)纖維化從而引起胎盤缺血低氧，進(jìn)而刺激胎盤HIF-1α/ET-1通路的過度表達(dá)，引發(fā)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的應(yīng)激化反應(yīng)導(dǎo)致胎盤局部損傷，這可能是妊娠期糖尿病患者不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)增大的一個重要原因[14]。此外，ET-1表達(dá)增加也可能會引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和氧化應(yīng)激，對患者的血液微循環(huán)及流變性造成一定影響，容易導(dǎo)致患者出現(xiàn)缺血、低氧甚至水腫等并發(fā)癥。由于ET-1主要分布于心血管內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)，因此HIF-1α/ET-1與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展也存在必然的聯(lián)系，例如心力衰竭、冠狀動脈疾病、原發(fā)性高血壓、動脈粥樣硬化、肺動脈高壓、腦梗死等[15]。

HIF-1α/ET-1在血管相關(guān)的病理生理學(xué)中具有重要的作用，其表達(dá)水平包括受體的循環(huán)水平和動態(tài)平衡變化可以影響很多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，而且它可以在其合成、受體結(jié)合或者胞內(nèi)信號傳導(dǎo)等各個節(jié)點(diǎn)受到其他因子的調(diào)控作用。ET-1受體拮抗劑可緩解血管炎癥，降低血管平滑肌細(xì)胞分化、鈣化。因此，以HIF-1α/ET-1為靶點(diǎn)的ET-1受體拮抗劑將會是一類很有前途的新型藥物，有望在血管相關(guān)疾病的防治方面起到特殊作用。

圖3 HIF-1α的過表達(dá)及干擾后內(nèi)皮細(xì)胞ET-1、ETA、ETB蛋白表達(dá)變化情況