五味子乙素通過誘導線粒體自噬減輕心肌缺血再灌注損傷

盧長青，賈合磊，雷 震，王 娟，任冬冬，楊敏華，陳亞奇

急性心肌梗死是導致臨床心血管病人死亡的主要原因[1]。目前，利用手術和藥物快速有效地恢復冠脈血流是治療缺血性心血管病的主要方法[2]。但心肌恢復血流灌注的同時又會造成心肌缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion, MI/R) 損傷，使心肌損傷進一步加重[3]。MI/R損傷涉及多個細胞及分子機制，如氧化應激、炎癥反應、鈣超載及線粒體自噬等[4-5]。研究[6]表明，線粒體自噬在MI/R損傷過程中發揮著重要的作用，線粒體自噬功能紊亂可加重小鼠MI/R損傷。五味子乙素 (schisandrin B, Sch B)是中藥五味子的有效成分之一，具有抗炎、抗氧化及抗癌等活性，還可減輕小鼠MI/R損傷[7]。但Sch B能否通過調控線粒體自噬減輕小鼠MI/R損傷還有待進一步研究。因此，該文復制MI/R小鼠模型以探究Sch B對MI/R損傷的作用及其機制，以期為Sch B的臨床應用提供實驗支撐。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器Sch B標準品購自上海哈靈生物科技公司；乳酸鹽脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸激酶 (creatine kinase, CK) 和HE染色試劑盒購自北京中山生物技術公司；TRIzol試劑盒、反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司；Beclin1、低氧誘導因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)、 一抗及HRP標記的山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司；小鼠呼吸機及心電圖儀購自成都太盟儀器公司；低溫離心機購自美國ThermoFisher公司。

1.2動物分組及模型建立60只3月齡雄性清潔級C57B/6J小鼠 (18～22 g) 由新鄉醫科大學實驗動物中心提供。飼養環境維持在室溫23 ～25 ℃內，濕度65%，12 h明暗交替，自由飲食和進水。適應性飼養3 d后進行實驗。將小鼠隨機分為Sham組、Sham+Sch B組、MI/R model組和MI/R model+Sch B組，用戊巴比妥鈉(80 mg/kg) 麻醉小鼠，仰臥位固定，連接肢體心電圖電極和呼吸機(呼吸頻率為60～70次/min)，記錄Ⅱ導聯心電圖，分離左側冠狀動脈，Sham組和Sham+Sch B組小鼠結扎左冠狀動脈前降支，MI/R model組和MI/R model+Sch B組小鼠結扎左冠狀動脈前降支45 min，隨后松開結扎線再灌注2 h。以缺血時局部心肌組織蒼白或發紺，心電圖ST段持續抬高，再灌注時心肌變紅潤且ST段下降視為造模成功。模型復制成功后，Sham+Sch B組和MI/R+Sch B組小鼠每天灌胃給予Sch B (80 mg/kg/d)，Sham組和Sham+Sch B組小鼠每天給予等量溶媒(無菌水)，連續灌胃30 d后處死小鼠進行后續實驗。

1.3AMPK-β1基因缺陷小鼠實驗所用到的45只SPF級腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase-β1, AMPK-β1) 基因敲除(AMPK-β1-/-) C57BL/6J雄性小鼠和15只SPF級野生型C57BL/6J雄性小鼠均由中國醫學科學院動物研究所提供，小鼠體質量為18～20 g。將小鼠飼養于SPF級環境下，自由進食，光照時間12 h，溫度25 ～27 ℃。以15只野生型(wild type, WT) 小鼠為Sham組，AMPK-β1-/-小鼠分為AMPK-β1-/- Sham組、AMPK-β1-/- MI/R model組和AMPK-β1-/- MI/R model+Sch B組。AMPK-β1-/- MI/R model組和AMPK-β1-/- MI/R model+Sch B組小鼠按照上述實驗方法復制MI/R模型，Sham組和AMPK-β1-/- Sham組處理則同上述Sham組處理方法相同。模型復制成功后，AMPK-β1-/- MI/R model+Sch B組灌胃給予Sch B，連續30 d，其余組灌胃給予等量溶媒。

1.4血清LDH和CK含量的測定給予受試物30 d后，進行摘眼球取血收集小鼠血液。將所收集血液室溫靜置1 h后，以3 000 r/min的轉速4 ℃離心15 min，取上層血清根據試劑盒說明書檢測各組小鼠血清LDH和CK的含量。

1.5心肌梗死面積的檢測給予受試物30 d后，處死小鼠，取出心臟。垂直于心臟長軸，由心尖向底部進行切片，共5片。將切片置于37 ℃、pH為7.4的TTC溶液中染色15 min，再用4%多聚甲醛固定。正常心肌顏色為紅色，缺血心肌顏色為灰白色，計算心肌梗死面積并進行統計分析。

1.6HE染色取心肌組織，用4%多聚甲醛固定過夜后，用不同濃度酒精進行梯度脫水，二甲苯進行透明，隨后將組織置于石蠟中，制作石蠟切片。最后根據HE染色試劑盒對組織切片進行HE染色。

1.7qRT-PCR根據TRIzol試劑盒說明書提取各組小鼠心肌組織總RNA。用逆轉錄試劑盒合成cDNA，熒光定量PCR試劑盒檢測cDNA含量，用2-△△Ct法對數據進行定量分析。實驗所用到的引物均由Qiagen公司設計合成。環氧化酶Ⅰ(cyclooxygenase Ⅰ, COXⅠ)上游引物：CACATGAGCAAAAG CCCACT，下游引物：ACGGCCGTAAGTGAGATGAA；環氧化酶Ⅳ(cyclooxygenase Ⅳ, COX Ⅳ)上游引物：GACTACCCCTTGCCTGATGT，下游引物： ACACGTAGCTCTTT CCCAG。

1.8Westernblot用RIPA裂解液提取各組小鼠心肌組織總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白濃度調平后，用10% SDS-PAGE將蛋白質分裂并轉移至PVDF膜。用5% 脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜2 h，2 h后加入一抗 (HIF-1α，1 ∶1 000；Beclin1，1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。第二天清洗PVDF膜后加入對應二抗室溫封閉1 h，滴加ECL顯色液進行曝光顯影。用Image J對蛋白質條帶灰度值進行定量分析。

表1 Sch B對MI/R小鼠心肌功能的影響

與Sham組比較：**P<0.01；與MI/R組比較：#P<0.05，##P<0.01

2 結果

2.1SchB對MI/R小鼠心肌功能的影響與Sham組比較，Sham+Sch B組小鼠血清LDH和CK含量無明顯變化，表明Sch B對小鼠心臟功能無明顯毒副作用 (P>0.05)；MI/R model組小鼠血清LDH和CK含量明顯增多 (P<0.001)；與MI/R model組比較，MI/R model+Sch B組小鼠血清LDH和CK含量則明顯降低，差異有統計學意義 (P<0.01)。同時，缺血再灌注能顯著增加MI/R model組小鼠心肌梗死面積，降低小鼠心率 (Heart rate, HR) (P<0.01，表1)；MI/R model+Sch B組小鼠心肌梗死面積 (Infracion area，IA) 與MI/R model組小鼠比較明顯減少，心率明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2SchB對MI/R小鼠心肌病理改變的影響HE染色結果顯示，與Sham組比較，Sham+Sch B組小鼠心肌組織無明顯改變；MI/R model組小鼠心肌組織心肌纖維排列紊亂，核固縮，心肌組織出現水腫，心肌間隙擴大。MI/R model+Sch B組小鼠心肌組織心肌纖維排列紊亂程度及間質水腫程度較MI/R model組比較均有所改善，見圖1。

2.3SchB對MI/R小鼠線粒體自噬的影響與Sham組比較，MI/R model小鼠心肌組織COX Ⅰ和COX Ⅳ mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)；MI/R model+Sch B組小鼠心肌組織COX Ⅰ和COX Ⅳ mRNA表達水平較MI/R model組比較明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。同時，與Sham組比較， MI/R model組小鼠心肌組織自噬標記蛋白HIF-1α和Beclin1表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖2。MI/R model+Sch B組小鼠心肌組織HIF-1α和Beclin1表達量明顯高于MI/R model組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 Sch B對MI/R小鼠心肌病理改變的影響 ×200

表2 Sch B對MI/R小鼠線粒體功能的影響

與Sham組比較：*P<0.05；與Sham組比較：#P<0.05；與MI/R model組比較：#P<0.05

2.4SchB對腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophosphateactivatedproteinkinase,AMPK)/雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)/ULK1信號通路的影響實驗結果表明，MI/R model組小鼠心肌組織p-AMPK和p-ULK1的蛋白表達水平較Sham組比較顯著降低 (P<0.05)，p-mTOR表達水平明顯升高 (P<0.05)；與MI/R model組比較，MI/R model+Sch B組小鼠心肌組織p-AMPK和p-ULK1的蛋白表達水平明顯升高 (P<0.05)，p-mTOR表達水平明顯降低 (P<0.05)，表明Sch B可誘導AMPK/mTOR/ULK1信號通路激活。見圖3。

圖2 Sch B對MI/R小鼠線粒體自噬的影響

圖3 Sch B對AMPK/mTOR/ULK1信號通路的影響

2.5敲除AMPK對心肌損傷的影響敲除AMPK-β1能顯著增加小鼠心肌梗死面積，降低小鼠心率，并抑制線粒體自噬相關蛋白HIF-1α和Beclin1表達 (P<0.05)。見表3、圖4；缺血再灌注可進一步增加AMPK-β1-/-小鼠的心肌梗死面積，降低小鼠心率及HIF-1α和Beclin1的表達，與AMPK-β1-/- Sham組比較差異有統計學意義 (P<0.05，P<0.05)。見表3、圖4，表明AMPK/mTOR/ ULK1信號通路參與了MI/R損傷的調控；Sch B能顯著縮小MI/R損傷AMPK-β1-/-小鼠的心肌梗死面積，明顯升高小鼠心率及HIF-1α和Beclin1蛋白表達水平，差異有統計學意義 (P<0.05)。見表3、圖4。

表3 敲除AMPK對小鼠MI/R損傷的影響

與Sham組比較：*P<0.05；與Sham+Sch B組比較：#P<0.05，##P<0.01；與MI/R model組比較：$P<0.05

圖4 敲除AMPK對線粒體自噬作用的影響

3 討論

缺血性心血管病是最常見的心血管疾病[8]。缺血后血流再通的一段時間內，患者臨床可發生血壓驟降、心功能不全、心律減慢甚至猝死等一系列病情惡化的現象，是導致缺血性心血管病人死亡的主要原因[9]。雖然MI/R損傷的機制已經明確，但目前仍然只有較少的藥物能影響MI/R預后[10]。因此，尋找新的藥物及治療方案減輕MI/R損傷是降低缺血性心血管病死亡率的關鍵。

本研究顯示Sch B能顯著降低MI/R模型小鼠血清LDH和CK的含量，縮小MI/R小鼠的心肌梗死面積，表明其具有明顯的心臟保護作用，可對抗MI/R損傷。同時，HE染色實驗表明Sch B還能明顯改善MI/R損傷引起的心肌組織病理改變，表明Sch B可緩解MI/R誘導的心肌損傷。已有研究[11]表明，Sch B能夠減輕MI/R損傷，具有較強的心肌保護作用。Zhang et al[10]研究顯示，Sch B可通過調控內質網應激抑制MI/R模型大鼠心肌細胞凋亡。Sch B還可通過增強心肌谷胱甘肽抗氧化作用減輕MI/R損傷[7]。本研究結果與之前研究一致，進一步證明Sch B具有明確的心肌保護作用。此外，本文對Sch B抗MI/R損傷的作用機制進行了探討。

本研究顯示，缺血缺氧環境可明顯降低線粒體標記蛋白COX I和COX IV的mRNA水平，表明缺血缺氧能下調線粒體功能。Sch B能顯著升高MI/R小鼠心肌組織COX I和COX IV的mRNA水平，同時還能誘導缺血缺氧后心肌組織HIF-1α和Beclin1的表達。研究[12]表明，缺氧環境可導致線粒體功能障礙，從而導致三磷酸腺苷產生不足及活性氧(ROS)過度產生，過多的ROS可誘導心肌細胞凋亡并進一步加重線粒體損傷。COX I和COX IV是線粒體呼吸過程中的重要限速酶，參與了線粒體損傷導致細胞凋亡的過程[13]。線粒體自噬是監測線粒體功能、清除受損線粒體的重要機制[14]。研究[15]顯示，線粒體自噬在MI/R損傷過程中具有心肌保護作用，其可能是通過清除受損線粒體調控線粒體功能、減少ROS產生，從而抑制心肌細胞凋亡，發揮心肌保護作用。已有研究[6]表明，缺氧環境可通過誘導線粒體自噬調控線粒體功能抑制心肌細胞凋亡。結合本實驗結果表明，Sch B可能通過誘導心肌組織線粒體自噬減輕MI/R損傷。

研究[16]表明，AMPK/mTOR/ULK1可調控心肌細胞自噬抑制缺氧損傷誘導的心肌細胞凋亡。Sch B能促進MI/R小鼠心肌組織p-AMPK和p-ULK1的表達，抑制p-mTOR的表達，表明Sch B可促進AMPK/mTOR/ULK1信號通路激活。此外，敲除AMPK基因MI/R小鼠腦梗死面積明顯增多，心率明顯降低，表明激活AMPK/mTOR/ULK1信號通路有利于減輕MI/R損傷。同時AMPK基因敲除小鼠經心肌缺血再灌注損傷處理后心肌組織HIF-1α和Beclin1表達水平較野生型小鼠明顯減少，提示AMPK/mTOR/ULK1信號通路參與了MI/R損傷后線粒體自噬的調控。