吡唑并[4,3-d]嘧啶衍生物的抗腫瘤篩選及其機制研究

陳 冉，王寶石，劉明明，劉新華，石靜波

神經膠質瘤是中樞神經系統內最常見的顱內惡性腫瘤，占所有顱內腫瘤發生率的40%～50%，并且有著高復發率、高致死率和低治愈率的特點[1]。盡管采用放射治療聯合替莫唑胺(temozolomide，TMZ)的標準治療方案，神經膠質瘤患者的存活率5年內仍然低于5%[2]。化學療法作為腫瘤三大治療方案之一，近年來在神經膠質瘤治療中受到的關注越來越多[3]。化療藥物結構多樣，很多藥物都是以雜環骨架為結構母核設計合成得到的。其中，氮取代的稠雜環化合物在抗腫瘤治療中有極大的研究價值[4]，如FDA已經批準上市的氮取代稠雜環類抗腫瘤藥物艾樂替尼、帕比司他、甲磺酸樂伐替尼等[5]。吡唑并[4,3-d]嘧啶是常見的氮取代稠雜環化合物之一，其作為潛在的抗腫瘤化療藥物受到了藥物化學領域的廣泛關注[6]。 PI3K/Akt/mTOR信號通路參與多種惡性腫瘤的發生[7]，研究[8]證明，抑制PI3K/Akt/mTOR通路是治療神經膠質瘤的潛在方案。因此，該研究對合成得到的吡唑并[4,3-d]嘧啶衍生物進行抗腫瘤活性篩選，選取神經膠質瘤U87-MG細胞，研究化合物9的體外抗腫瘤作用，初步探討其作用機制，為吡唑并[4,3-d]嘧啶衍生物的抗腫瘤研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人肝癌SMMC-7721細胞、人胃癌SGC-7901細胞、人神經膠質瘤U87-MG細胞和人胃癌MGC-803細胞均由安徽醫科大學藥學院提供。

1.1.2主要試劑 化合物1～10由安徽醫科大學藥學院藥化教研室合成提供；DMEM高糖培養基、二甲基亞砜購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物材料有限公司；胰酶購自上海生工生物工程股份有限公司；噻唑藍購自北京奇華盛生物技術有限公司；兔抗Bax、Bcl-2、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR購自美國Abcam公司；抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Annexin V-FITC購自美國貝博公司。

1.1.3主要儀器 Multiskan MK3酶標儀購自荷蘭Thermo forma儀器有限公司；NAPCO-6100型細胞培養箱購自美國SHELLAB公司；Sigma3-16K高速離心機購自美國Sigma公司；Bio-Rad powerpac 164-5070電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，穩定傳2～3代后，取對數生長期的細胞做后續實驗。

1.2.2細胞增殖實驗 收集對數期細胞，計數，調整細胞懸液濃度，以4 000個/100 μl/孔，接種于96孔板，37 ℃、5% CO2條件下培養24 h后至細胞單層鋪滿孔底面積的2/3。從孔邊緣小心吸棄培養基，各加入一定濃度梯度的化合物，100 μl /孔，每組設4個平行復孔，分別培養24、48、72 h。避光條件下，加入MTT溶液20 μl /孔，繼續放入培養箱中培養4 h。小心吸去孔內培養液，加入DMSO，150 μl /孔，置搖床上低速振蕩15 min。在酶標儀492 nm處測量各孔的吸光度值(optical density,OD)，以對照孔調零。記錄結果并計算細胞抑制率，抑制率(inhibitory concentration，IC)(%)=[(1-(實驗組OD均值-空白組OD均值)/(對照組OD均值-空白組OD均值)]×100 %，實驗重復操作3次，并計算均值和半數抑制濃度(IC50)。

1.2.3Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡 取對數生長期的U87-MG細胞，分別予以相應濃度的化合物9(2、4、8 μmol/L)處理24 h，用4 ℃預冷的PBS洗滌并收集所有細胞，制備單細胞懸液，離心棄去上清液，加入400 μl的Annexin V Buffer工作液重懸細胞，再加入5 μl Annexin-V-FITC染色液，4 ℃避光孵育15 min，加入10 μl PI染色液同條件下孵育10 min，在1 h內進行流式細胞儀檢測。

1.2.4Western blot檢測 將U87-MG細胞接種于六孔板中(0.25×106/ml)，2 ml/孔，待細胞貼壁后，加入上述三種濃度的化合物9，處理24 h。收集細胞，并用4 ℃預冷的PBS洗滌細胞，按照1 ml裂解液加入10 μl PMSF的配方，加入適量裂解液，搖勻置于冰上裂解30 min，4 ℃、13 000 r/min離心5 min，取上清液采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品中蛋白含量，并稀釋配平。蛋白樣品采用10%～12%的SDS-PAGE電泳，200 mA恒流條件下將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1～2 h，置于搖床上緩慢震蕩，TBST洗膜3次后，4 ℃孵育一抗(按照1 ∶1 000比例稀釋)過夜，TRIs-HCL-Tween TBST洗膜3次后，室溫孵育二抗(按照1 ∶10 000比例稀釋)1 h，TBST洗膜3次后，采用ECL化學發光法觀察蛋白表達情況。

2 結果

2.1吡唑并[4,3-d]嘧啶衍生物的抗腫瘤活性評價MTT法檢測10個化合物對四株腫瘤細胞株(人肝癌SMMC-7721細胞、人胃癌SGC-7901細胞、人胃癌MGC-803細胞和人神經膠質瘤U87-MG細胞)的增殖抑制情況，化合物處理時間為48 h，阿霉素(ADM)做陽性對照藥，見圖1。數據經SPSS 17.0分析，得到具有較好抗腫瘤活性(IC50≤60 μmol/L)的化合物，見表1。結果顯示，化合物4、5、8和9對四株腫瘤細胞株均有明顯增殖抑制作用，其中，化合物9抑制神經膠質瘤U87-MG細胞增殖作用最強，IC50僅為(2.22±0.67) μmol/L，小于神經膠質瘤細胞陽性藥TMZ的IC50。表明化合物9可能是治療神經膠質瘤的潛在先導物。因此，就該化合物9的抗神經膠質瘤的作用機制開展了初步的研究。

圖1 化合物1～10的化學結構

表1 化合物對不同腫瘤細胞株的

-：表示 半數抑制率IC50>60 μmol/L；NT：表示不具有檢測意義

2.2化合物9對神經膠質瘤U87-MG細胞增殖的影響MTT法檢測結果顯示：化合物9處理U87-MG細胞24 h后，濃度在2、4、8 μmol/L時，增殖已經有顯著抑制(t=3.283，P<0.01)，IC50為(4.37±1.13) μmol/L；處理U87-MG細胞48 h后，細胞抑制率升高(t=2.945，P<0.01)，IC50為(2.22±0.67)μmol/L；處理U87-MG細胞72 h后，細胞增殖普遍被抑制(t=3.174，P<0.01)。見圖2。表明化合物9對神經膠質瘤U87-MG細胞增殖具有顯著抑制作用，并呈現時間-劑量依賴性。因此，本實驗選定2、4、8 μmol/L 3個濃度作為后續實驗的給藥濃度，給藥時間為24 h。

2.3化合物9對神經膠質瘤U87-MG細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達的影響采用不同濃度(2、4、8 μmol/L)的化合物9處理U87-MG細胞24 h后，用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測各組細胞凋亡率。檢測結果顯示：細胞凋亡率隨著化合物9濃度升高而增加，呈劑量依賴關系。當化合物9濃度達到8 μmol/L時，細胞凋亡率與對照組的相比顯著增加。見圖3。提取各組總蛋白，用Western blot檢測技術檢測U87-MG細胞凋亡相關因子的表達情況。結果顯示，隨著藥物濃度增大，抗凋亡蛋白Bcl-2表達量減少，促凋亡蛋白Bax的表達上調。見圖4。

2.4化合物9對神經膠質瘤U87-MG細胞相關信號通路蛋白表達的影響U87-MG細胞分別經2、4、8 μmol/L 3個濃度處理24 h后，采用Western blot技術檢測信號通路蛋白(p-mTOR、 mTOR、p-Akt和Akt)的表達情況。p-mTOR蛋白和p-Akt蛋白的表達量都隨著化合物9濃度增加而減少，與此同時，mTOR蛋白和Akt蛋白的表達量沒有受到化合物9濃度改變的影響，基本保持不變。見圖5。提示化合物9可能通過抑制PI3K/ Akt/ mTOR信號通路誘導神經膠質瘤U87-MG細胞發生凋亡。

圖2 化合物9對神經膠質瘤U87-MG細胞增殖的影響

3 討論

腦神經膠質瘤是由大腦膠質細胞癌變所產生的、最常見的原發性顱內腫瘤[9]，為了克服這一難題，近年來國內外相繼展開了大量關于神經膠質瘤化療藥物的研究。化療藥物結構類型多，基于基本結構骨架進行結構修飾，是尋找新型化療藥物的常用手段。文獻研究表明許多藥物是基于吡唑并嘧啶母核結構進行結構改造或者修飾產生的，例如別嘌呤醇[10]、扎來普隆、茚地普隆[11]等。吡唑并嘧啶有多個同分異構體，包括吡唑并[1,5-a]嘧啶、吡唑并[5,1-b]嘧啶、吡唑并[4,3-d]嘧啶和吡唑并[3,4-d]嘧啶等，均具有重要且廣泛的藥理學研究價值。其中，吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物被證實具有明顯的抑制腫瘤細胞增殖的作用，可作為抗腫瘤藥物骨架被修飾。因此，大量的吡唑并[4,3-d]嘧啶衍生物被合成出來，以評價其抗腫瘤活性并研究其作用機制，然而其在神經膠質瘤上的抗腫瘤研究卻很少被報道。本研究選取4種腫瘤細胞株(人肝癌SMMC-7721細胞，人胃癌SGC-7901細胞，人神經膠質瘤U87-MG細胞和人胃癌MGC-803細胞)，對合成的吡唑并[4,3-d]嘧啶衍生物進行體外抗腫瘤活性篩選，結果表明，化合物9在神經膠質瘤U87-MG細胞上的抗腫瘤活性最強，有望作為抗神經膠質瘤的先導物展開進一步研究。因此，該研究以神經膠質瘤U87-MG細胞為研究對象，觀察化合物9對該細胞的增殖和凋亡的影響，結果表明，化合物9顯著抑制神經膠質瘤U87-MG細胞增殖，并且促進其凋亡。

圖3 化合物9對神經膠質瘤U87-MG細胞凋亡率的影響

圖4 化合物9對神經膠質瘤U87-MG細胞凋亡相關蛋白的影響

在腫瘤細胞內，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)會被激素、生長因子和其他刺激因子激活，活化的PI3K激酶會生成第二信使即三磷脂酰肌醇(3-phosphoinositide, PIP3)，三磷脂酰肌醇作用于下游的信號分子Akt，導致AKt構象改變，同時磷酸化Akt蛋白上的Ser124/Thr450和Thr308/Ser473兩個位點，繼而使Akt激活，活化的Akt進一步激活下游信號分子mTOR，激活的mTOR通過調控兩個下游分子核糖體S6蛋白激酶(S6K)和真核生物啟動因子4E結合蛋白1(4E-BP1)從而調控腫瘤細胞的增殖和凋亡。據報道[12]，活化的PI3K/ Akt/ mTOR信號通路會使細胞產生抗藥性從而削弱神經膠質瘤化療藥物TMZ的治療效果。因此，抑制PI3K/ Akt/ mTOR信號通路是治療神經膠質瘤極有潛力的研究方向[13]。本研究顯示，化合物9處理24 h后的神經膠質瘤U87-MG細胞中，在Akt和mTOR總蛋白的表達量基本無變化的前提下，它們的下游通路蛋白p-Akt和p-mTOR的蛋白含量都減少。化合物9可能是通過抑制PI3K/ Akt/ mTOR通路促進神經膠質瘤U87-MG細胞凋亡。

圖5 化合物9對神經膠質瘤U87-MG細胞凋亡相關信號通路蛋白的影響

綜上所述，化合物9可作為治療神經膠質瘤的潛在新型先導物。該研究為吡唑并[4,3-d]嘧啶衍生物的抗腫瘤研究提供了一定的實驗依據。