江西地區心腦血管患者CYP2C19基因多態性檢測

余龍輝，周 潔，葉舒慧，咼 陽

心腦血管疾病是一種嚴重威脅人類健康的全球性疾病，尤其是影響50歲以上的中老年人健康的常見病，即使應用當下最先進、完善的治療手段，仍可有50%以上的幸存患者生活不能完全自理。當前，氯吡格雷(clopidogrel)作為第二代噻吩吡啶類抗血小板藥物，在心腦血管疾病的防治中運用廣泛，主要作用于防止血栓形成方面。但研究[1-3]表明，氯吡格雷抗血栓作用并不能使所有患者受益，不同患者對氯吡格雷的反應有差異，同時部分患者反應性較低或無反應，稱之為氯吡格雷低反應或氯吡格雷抵抗。然而其具體機制尚未明確，不過越來越多研究[4-5]顯示基因多態性是氯吡格雷抵抗的一個重要原因。隨著遺傳藥理學的發展，藥物代謝酶基因中的某些位點的多態性可引起相應酶含量或酶活性的變化，從而影響藥物代謝能力。而細胞色素P4502C19(cytochrome P450,family2,subfamily C, polypetide19,CYP2C19)酶作為細胞色素P450藥物代謝酶家族中的重要一員，是氯吡格雷在體內生物代謝的關鍵酶，該研究旨在分析江西地區心腦血管患者CYP2C19基因型分布情況，以指導臨床更合理地應用氯吡格雷，降低心臟再缺血、冠狀動脈支架內血栓[6]和缺血性腦卒中[7]等不良心腦血管事件的風險，為實現個性化用藥奠定遺傳學基礎。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2016年1月～2018年1月因心腦血管疾病就診于南昌大學第一附屬醫院3 408例患者，男2 183例， 22～94歲，中位年齡 67歲，女1 225例， 17～95歲，中位年齡70歲。抽取患者EDTA抗凝靜脈血2～3 ml，當天提取DNA。

1.2儀器與試劑全自動基因提取儀購自蘇州天隆公司，熒光定量PCR儀(ABI7500)購自美國應用生物系統公司，CYP2C19基因檢測試劑盒購自蘇州曠遠生物分子技術有限公司。

1.3方法

1.3.1DNA提取 利用全自動基因提取儀進行提取所用標本DNA，具體步驟見說明書，并用定量分析儀檢測其濃度和純度合格后用于后續熒光定量PCR。

1.3.2熒光定量PCR法檢測CYP2C19基因型 按照說明書指示，每份標本需添加四種反應液，即CYP2C192G、2A、3G及3A PCR反應液，同時加入內參探針對本次反應結果進行質量控制，并且每次實驗均帶上陽性對照和空白對照。PCR反應總體系：25 μl，其中上述四種反應液各23 μl，酶1 μl，模板1 μl。整個熒光定量PCR反應在ABI7500儀上進行。反應條件見說明書。程序結束，觀察擴增曲線，分析Ct值數據，進行基因型結果判讀。

1.3.3CYP2C19基因型檢測 本實驗共檢測6種基因型：CYP2C19*1/*1、*1/*2、*1/*3、*2/*2、*2/*3和*3/*3型。3種代謝型判讀方法為：*1/*1為快代謝型；*1/*2和*1/*3為中代謝型；*2/*2、*2/*3和*3/*3均為慢代謝型。

1.4統計學處理采用SPSS 19.0進行統計分析，計數資料采用百分數表示，組間比較用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CYP2C19基因型分布采用“等位基因特異PCR”技術結合熒光探針檢測CYP2C19基因，本研究3 408例患者中，結果顯示CYP2C19基因型由多到少分布為*1/*2、*1/*1、*2/*2、*1/*3、*2/*3、*3/*3，所占比例分別為40.5%、40.1%、10.3%、5.9%、3.0%、0.3%。其男女基因型所占比例，差異無統計學意義(χ2=2.807，P=0.73)，見圖1。

圖1 CYP2C19基因型在不同性別中的分布[n(%)]

2.2CYP2C19等位基因在不同性別中的頻率分布本研究3 408例患者中,CYP2C19*1、*2、*3的基因頻率分別為63.3%、32.0%、4.7%，其在不同性別中的比例，差異無統計學意義(χ2=0.67，P=0.715)，見圖2。

2.3氯吡格雷不同代謝型在不同性別中的分布本研究3 408例患者中，根據基因型判讀，氯吡格雷代謝型主要以中代謝型(46.4%)為主，快代謝型和慢代謝型分別為40.1%和13.5%，其在不同性別中的比例，差異無統計學意義(χ2=0.471，P=0.79)，見圖3。

2.4不同年齡段氯吡格雷代謝型于不同性別中的分布將3 408例患者分為6個年齡段，各年齡段各代謝型分別在男性和女性中所占比例比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

圖2 CYP2C19等位基因在不同性別中的頻率分布[n(%)]

圖3 氯吡格雷代謝型在不同性別中的分布[n(%)]

表1 不同年齡段氯吡格雷代謝型在不同性別中的分布[n(%)]

3 討論

隨著人口老年化數量不斷增加，我國心腦血管疾病患者基數也在不斷增長，而氯吡格雷作為第二代噻吩吡啶類抗血小板藥物，在心腦血管疾病的防治中效果顯著，目前國內外臨床研究[8]均提示經皮冠狀動脈介入治療術后可通過服用氯吡格雷以達抗血小板的功能，從而降低心血管事件發生率；同時，指南[9]指出氯吡格雷還可作為缺血性腦卒中及短暫性腦缺血發作二級預防的首選抗血小板藥物。但是，氯吡格雷抗血小板作用普遍存在著個體差異，部分患者服用常規劑量氯吡格雷仍有較高的血小板活性，血栓事件的發生概率往往增加，以往認為這可能與藥物間相互作用或患者依從性差等有關系，而氯吡格雷本身為無活性的一種前體藥物，需在肝臟經過CYP2C19酶代謝生成活性產物，從而發揮抑制血小板的激活和聚集的作用[10]。而CYP2C19蛋白主要由CYP2C19基因介導，越來越多研究[10]表明CYP2C19基因多態性對CYP2C19酶活性起著重要作用。CYP2C19基因位于10號染色體10q24上，除了野生型等位基因CYP2C19*1，還存在多種單核苷酸多態性，而CYP2C19*2和CYP2C19*3為中國人最常見的等位基因，也稱為功能缺失性等位基因。研究[11]顯示其在氯吡格雷抵抗人群出現的頻率大大高于非氯吡格雷抵抗人群，因此在實際臨床應用中，可通過患者CYP2C19基因代謝型適當調整氯吡格雷劑量，以真正做到個體化醫療。

隨著精準醫療的提出，越來越多熱門遺傳基因檢測再次被人們所提及和關注，相關報道指出CYP2C19存在著廣泛的地域、種族差異，探討不同地區不同種族的CYP2C19基因多態性的分布特征將有助于指導臨床用藥。本研究的主要人群為南昌大學第一附屬醫院的心腦血管患者，共計3 408例患者，男2 183例，22～94歲，中位年齡67歲，女1 225例，17～95歲，中位年齡70歲，本研究采用“等位基因特異PCR”技術結合熒光探針的方法對3408例江西地區心腦血管患者進行CYP2C19基因多態性檢測，結果顯示CYP2C19*1、*2、*3的基因頻率分別為63.3%、32.0%、4.7%，其CYP2C19*1型的攜帶率最高；而CYP2C19*1/*1、CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3、CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*3/*3基因型的頻率分別為40.1%、40.5%、5.9%、10.3%、3.0%、0.3%，CYP2C19*1/*2型占江西地區的主導；其正常代謝型、中間代謝型、慢代謝型的頻率分別為40.1%、46.4%、13.5%，以中間代謝型為主，與張愛玲 等[12]報道一致，仍有13.5%的患者為慢代謝型，其氯吡格雷低反應或氯吡格雷抵抗現象嚴重，應考慮調整劑量或換藥；不同性別之間CYP2C19基因型及代謝型差異均無統計學意義(P>0.05)，各年齡段各代謝型差異也無統計學意義(P>0.05)這與相關文獻[13-14]報道一致。本研究病例基數較大、年齡跨度大以及性別分布合理，能較好地體現江西地區CYP2C19基因多態性的分布特征。

心腦血管疾病作為我國疾病主要死因之一，為了更好地預防和治療，氯吡格雷用藥前的CYP2C19基因分型檢測勢在必行，本研究顯示CYP2C19*1/*2型占江西地區的主導基因型，同時患者的年齡和性別與CYP2C19基因型分布并無直接影響，CYP2C19*1/*2作為中代謝型，據2013版臨床藥物基因組學實施聯盟指南[15]指出CYP2C19*1/*2型急性冠脈綜合征/經皮冠狀動脈介入治療患者常規劑量氯吡格雷可能效果不佳,可根據療效適當小幅增加劑量,或換其他抗血小板藥物，從而為患者制定個體化醫療方案，更大程度地降低不良事件的發生。