stomatin對非小細胞肺癌細胞中葡萄糖轉運蛋白1表達及定位的影響△

劉明依，安華英，袁偉#，馬潔2國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院分子腫瘤學國家重點實驗室，北京0002

2北京醫院生物治療中心/國家老年醫學中心，北京100730 0

stomatin蛋白是一種單向、低聚合的脂筏相關蛋白，也稱作band 7.2b。該蛋白組織細胞膜的膽固醇依賴性調節過程，并參與調節離子通道的生理過程，最初是在研究遺傳性口形紅細胞增多癥（一種溶血性貧血）病因時從正常人紅細胞質膜中被分離出來[1-3]。近年來研究發現stomatin在多種惡性腫瘤中的表達異常，提示其可能參與腫瘤的發生發展過程。Montel-Hagen等[4]發現在少數無法合成維生素C的哺乳動物紅細胞膜中，stomatin能夠與葡萄糖轉運蛋白1（glucose transporter 1，Glut1）相互作用，影響Glut1的葡萄糖吸收速率。Glut1是Glut家族的首要成員，存在于多種正常組織中（腦和紅細胞中存在豐富，動物脂肪、肌肉、肝臟、胰腺中表達量一般）[5]。現階段普遍認為在主要組織中，Glut1起到主要的葡萄糖攝取功能。據研究Glut1已被證明是惡性腫瘤細胞中葡萄糖轉運的關鍵限速因子，在不同類型的人類腫瘤中過度表達，如肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌和結直腸癌等[6-10]。stomatin與Glut1相互作用關系的改變可以影響葡萄糖攝取的機制尚不清楚。因此，本研究對stomatin與Glut1的相互作用進行探究，以證實stomatin基因對非小細胞肺癌細胞中Glut1表達及定位的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人肺鱗癌細胞系H520購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心，人肺腺癌細胞系A549購自美國模式菌種收集中心。

1.2 主要試劑和儀器

PRMI 1640培養基、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購自美國Sigma公司；F12K培養基購自美國Gibco life technology公司；stomatin、Glut1抗體購自美國Abcam公司；LipofectamineTM2000試劑盒、Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG、Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG購自美國Life Technology公司；過表達stomatin基因慢病毒、病毒感染試劑HitransG P購自中國吉凱基因公司；普通DNA產物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、高純度質粒小提試劑盒購自中國天根生化科技有限公司；Prime ScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自日本Takara公司；ribo-FECTTMCP轉染試劑盒購自中國銳博生物公司；PE anti-DYKDDDDK流式抗體購自美國Biolegend公司。正置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，流式細胞儀購自美國Becton-Dickinson公司，ELX800酶標儀購自美國BIO-TEK Instrument公司，Image QuantTMLAS 4000數字成像系統購自美國GE Healthcare Life Sciences公司，激光共聚焦顯微鏡成像系統購自德國Leica Microsystems公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 人肺腺癌細胞系A549放入含10%BSA的F12K培養基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中傳代培養；人肺鱗癌細胞系H520放入含10%BSA的PRMI 1640培養基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中傳代培養。

1.3.2 stomatin siRNA轉染A549、 H520細胞 取對數生長期的A549、H520細胞，分別以2×105/孔接種于6孔板內，培養24 h。待達到40%～60%融合度時，按照riboFECTTMCP轉染試劑盒說明書轉染細胞。轉染stomatin siRNA下文以A549sistom、H520-sistom表示，轉染control siRNA下文以A549sinc、H520sinc表示。

1.3.3 蛋白質印跡法（Westernblot）檢測stomatin蛋白及Glut 1蛋白表達 提取A549sinc、A549sistom、H520sinc、H520sistom細胞總蛋白，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度。取等量蛋白質進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，200 mA恒定電流轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶4℃封閉過夜。stomatin、Glut1抗體（均1∶1000稀釋）和內參β-actin抗體（1∶3000稀釋）室溫孵育2 h，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗鼠抗體和羊抗兔抗體（1∶3000稀釋），室溫孵育1 h。采用化學發光法顯色并曝光。實驗重復3次，取平均值。

1.3.4 RNA的提取和實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測stomatin及Glut 1基因表達情況 以Trizol法提取 A549sinc、A549sistom、H520sinc、H520sistom細胞的總RNA，提取方法參見說明書。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測 stomatin、Glut1基因表達情況，反應條件參見SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書，其中擴增溫度分別為57℃和63℃，選取 β-actin 為內參基因，采用 2-△△Ct方法計算。stomatin基因的正向引物序列為5'-CACACACGGGACTCCGAAG-3'，反向引物序列為5'-ATGAGAACGCCACCAAAATCC-3'；Glut1基因的正向引物序列為5'-GGCCAAGAGTGTGCTAAAGAA-3'，反向引物序列為5'-ACGCGTTGATGCCAGACAG-3'。實驗重復3次，取平均值。

1.3.5 細胞免疫熒光染色 取stomatin siRNA轉染24 h后的A549、H520細胞，以1×105/孔加入至24孔板中進行細胞爬片，3%甲醛和2%蔗糖溶液固定15 min，0.1 mmol/L甘氨酸室溫孵育5 min，1%BSA室溫封閉2 h以上。加入stomatin與Glut1混合抗體稀釋液，室溫孵育3 h，PBS洗滌，加入二抗稀釋液，室溫避光孵育 1 h，PBS洗滌，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核，封片。實驗重復3次，取平均值。

1.3.6 慢病毒感染A549、H520細胞構建過表達stomatin基因細胞系 以1.5×105/孔將細胞接種于24孔板，使用相應培養基培養過夜。感染前使用完全培養基1∶25稀釋病毒感染試劑HitransG P，并替代舊培養基。24孔板每孔500 μl。根據細胞感染復數（multiplicity of infection，MOI）值加入相應病毒使用量，MOIA549=10，MOIH520=50。

1.3.7 3×flag-Glut 1-PcDNA 3.1（-）質粒的構建及轉染 A549、 H520細胞在Glut1的第一個細胞外段序列中插入3個連續的flag標簽。選取PcDNA3.1（-）作為載體，利用酶切、連接技術將含有flag標簽的Glut1序列插入其中，構建完成3×flag-Glut1-PcDNA3.1（-）質粒。取對數生長期的過表達stomatin的A549、H520細胞，分別以2×105/孔接種于6孔板內，培養24 h。待達到60%～80%融合度時，按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書轉染細胞。實驗組轉染 3×flag-Glut1-PcDNA3.1（-）質粒，對照組轉染 PcDNA3.1（-）質粒。

1.3.8 流式細胞術檢測Glut 1細胞內定位情況將完成 3×flag-Glut1-PcDNA3.1（-）轉染的 A549、H520細胞制成單細胞懸液，加入PE anti-DYKDDDDK抗體4℃孵育30 min，PBS洗滌，上機檢測。實驗重復3次，取平均值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌細胞 A549、H520中敲降stomatin表達對Glut 1表達的影響

利用siRNA敲降A549、H520細胞中的stomatin基因，qRT-PCR結果顯示，與A549sinc相比，stomatin敲降后的A549細胞中stomatin的mRNA表達量變化為（0.14±0.11）倍，差異有統計學意義（t=13.860，P﹤0.01）；Glut1的 mRNA 表達量變化為（0.93±0.33）倍，差異無統計學意義（t=0.371，P﹥0.05）。與H520sinc相比，stomatin敲降后的H520細胞中stomatin的mRNA表達量變化為（0.07±0.03）倍，差異有統計學意義（t=46.500，P﹤0.01）；Glut1的mRNA表達量變化為（0.92±0.34）倍，差異無統計學意義（t=0.386，P﹥0.05）。Western blot結果顯示，敲降stomatin后，A549及H520細胞中stomatin的蛋白表達量降低，而Glut1的蛋白表達量不變（圖1）。

2.2 肺癌細胞 A549、H520中敲降stomatin表達對Glut 1蛋白表達位置的影響

圖1 Western blot法檢測轉染后 A549、 H520細胞中stomatin蛋白及Glut 1蛋白的表達情況

stomatin siRNA 轉染 A549、H520細胞后，對A549、H520兩種細胞的對照組和實驗組的stomatin、Glut1蛋白和細胞核進行細胞免疫熒光染色，結果顯示，stomatin與Glut1存在緊密的共定位情況。與A549sinc相比，A549sistom中Glut1蛋白的主要表達位置由細胞膜轉移至細胞質內；H520細胞中stomatin與Glut1蛋白的表達雖未及A549細胞明顯，但呈現一致的Glut1轉位現象。（圖2）

2.3 肺癌細胞 A549、H520中stomatin的過表達對Glut 1蛋白表達位置的影響

圖2 細胞免疫熒光染色顯示肺癌細胞 A549、 H520中敲降stomatine表達對Glut 1蛋白表達位置的影響（×630）

為了檢測Glut1在細胞膜上表達的變化，本研究在Glut1蛋白的第一個細胞外環上插入flag標簽，構建 3×flag-Glut1-PcDNA3.1（-）質粒。向過表達stomatin的A549、H520細胞中導入3×flag-Glut1-PcDNA3.1（-）質粒，流式抗體識別flag標簽檢測Glut1蛋白在細胞膜的表達情況。stomatin過表達的A549細胞中3×flag-Glut1在細胞膜的表達率為（1.30±0.13）%，明顯高于對照組A549細胞的（0.53±0.23）%，差異有統計學意義（t=7.690，P﹤0.01）；stomatin過表達的H520細胞中3×flag-Glut1在細胞膜的表達率為（24.07±0.83）%，明顯高于對照組H520細胞的（20.17±0.93）%，差異有統計學意義（t=5.414，P﹤0.01）。

3 討論

Glut1是Glut家族的首要成員，已被證明是惡性腫瘤細胞中葡萄糖轉運的關鍵限速因子，并在不同類型的人類腫瘤中過度表達。大量的研究表明，Glut1參與了腫瘤細胞的生長和轉移。此外，Glut1的過度表達與血管浸潤、微血管密度和腫瘤浸潤深度有關[11]。

作為腫瘤細胞攝取葡萄糖的關鍵載體，Glut1主要分布在細胞膜，在細胞質內也存在富含Glut1的囊泡，但只有細胞膜表面的Glut1增多時，細胞對葡萄糖的攝取量才能增加。早在1995年，科學家就發現白細胞介素-3（interleukin-3，IL-3）和激酶的激活通過促進Glut1向細胞表面的易位來刺激葡萄糖轉運[12]。由生長因子或致癌基因調控的Glut1轉位可能在抑制造血細胞的細胞凋亡中起重要作用。而后的研究表明，IL-3能夠使磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）活化進而激活蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT），通過RAB11A依賴的細胞內蛋白循環使得Glut1能夠在細胞膜上表達[5]。不只是PI3K/PKB信號通路對Glut1轉位進行調控，TP53的相關通路也起到了一定作用。腫瘤相關突變的p53可以激活Warburg效應。這種激活Warburg效應的機制為通過激活Ras同源基因家族成員A（Ras homolog gene family member A，RhoA）和其下游效應器Rho激酶（Rho-associated coiled-coil-forming kinase，ROCK），促進Glut1轉位到細胞膜上。在饑餓和壓力環境下，腫瘤細胞會啟動自噬反應，通過增加細胞表面Glut1的表達促進葡萄糖的攝取和糖酵解的流向[13]。有報道指出，在代謝壓力下，表達微管相關蛋白輕鏈3陽性（light chain 3，LC3）的自噬泡與Retromer復合體結合從而隔斷自噬泡與TBC1域家族成員 5（TBC1 domain family member 5，TBC1D5）的結合，將其招募到內含體膜上形成Glut1的轉位。因此在代謝壓力引起的自噬中，TBC1D5能夠關閉Retromer依賴的Glut1轉位，以保證Glut1在細胞膜上的表達，維持葡萄糖的攝取[14]。雖然目前科學家們對Glut1的轉位調控進行了一些信號通路相關研究，但是具體的調控機制還有待研究。

本研究對非小細胞肺癌細胞A549、H520中stomatin與Glut1之間的調控關系進行了探究。首先通過RNA干擾技術降低stomatin的表達，發現在A549、H520細胞中stomatin表達的降低并不影響Glut1的表達。Kumar等[15]檢測了在正常的3T3-L1脂肪細胞中，Glut1在Triton X-100可溶性和不溶性部分中的分布，幾乎90%的細胞膜池中的stomatin都是耐洗滌劑的脂筏，該研究結果顯示在正常的3T3-L1脂肪細胞中，無法在免疫共沉淀實驗中證明Glut1和stomatin之間的相互作用。然而，在過表達stomatin的細胞中，stomatin與Glut1抗體明顯共沉淀。故猜測stomatin能夠在非小細胞肺癌細胞中起到Glut1轉位的關鍵作用。本研究在Glut1的第一個細胞外跨膜區插入flag標簽，通過識別flag標簽，利用流式細胞術檢測Glut1在細胞膜上的表達情況，研究結果發現在stomatin過表達的A549、H520細胞中，Glut1在細胞膜中的表達量升高。而利用細胞免疫熒光染色技術發現stomatin表達量降低時，Glut1的表達從細胞膜上轉移到了細胞質中。根據這些結果，猜測stomatin是通過影響Glut1表達位置的變化影響Glut1的功能。