血清外泌體miRNA-184在非小細胞肺癌中的表達水平及其診斷效能

劉玉山，閆紅江，李春雨北京市東城區第一人民醫院呼吸科，北京100075

2河北醫科大學第二醫院胸外科，石家莊050000 0

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，流行病學調查研究顯示，該病的發病率和病死率均較高[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是一種常見的肺癌類型，約占肺癌總數的80%，由于NSCLC起病隱匿，故多數患者就診時已處于中晚期[2-3]。以往的研究顯示，Ⅰ期NSCLC患者術后5年生存率可達80%，而晚期NSCLC患者術后5年生存率僅為15%，且術后復發率極高[4]，因此，尋找NSCLC特異性腫瘤標志物對該病的早期診療具有重要的臨床意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年來發現的一種內源性非編碼小分子RNA，可參與細胞的增殖、分化及凋亡等過程，在多種組織中均有表達，具有較好的組織特異性[5]。文獻報道，外泌體可介導miRNA轉運，使其穩定地存在于循環系統中，因肺癌中miRNA表達失調不盡相同，故血清外泌體miRNA具備了成為腫瘤生物標志物的條件[6]。本研究通過對比分析NSCLC患者、肺炎患者及健康體檢者的血清外泌體miRNA-184的表達水平，探討血清外泌體miRNA-184對NSCLC的診斷效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2015年6月至2018年3月于北京市東城區第一人民醫院診治的NSCLC、肺炎患者的臨床資料及同期健康體檢者的體檢結果。納入標準：NSCLC患者均經組織病理學檢查確診，肺炎患者均經臨床檢查確診，且采集標本前均未接受相關治療。排除標準：NSCLC、肺炎患者的臨床資料及健康體檢者的體檢結果不完整，影響本研究相關數據的統計分析。根據納入、排除標準，共納入NSCLC患者66例、肺炎患者60例及同期健康體檢者30例。66例NSCLC患者中，男39例，女27例；平均年齡為（51.67±4.96）歲；吸煙38例，占57.58%；病理類型：腺癌41例，鱗癌25例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期36例，Ⅲ～Ⅳ期30例；有淋巴結轉移34例，占51.52%。60例肺炎患者中，男36例，女24例；平均年齡為（51.23±4.42）歲；吸煙31例，占51.67%。30例健康體檢者中，男17例，女13例；平均年齡為（50.14±3.57）歲；吸煙17例，占56.67%。NSCLC、肺炎患者與健康體檢者的性別、年齡、吸煙比例比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）。

1.2 儀器及試劑

7500型實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（quantitativereal-time reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀購自美國應用生物系統（ABI）公司，jem-100cxⅡ型透射電子顯微鏡購自日本電子公司，分光光度計購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司，外泌體提取試劑盒購自SBI公司，逆轉錄試劑盒、qPCR試劑盒購自美國ABI公司，總RNA提取試劑（Trizol）試劑購自Invitrogen公司，納米顆粒跟蹤分析儀Nanosight NS300購自Malvern公司。

1.3 研究方法

NSCLC、肺炎患者與健康體檢者的血清標本均于采集24 h內予以離心處理，取上層血清，于-80℃保存待檢，全過程避免溶血。

1.3.1 血清外泌體的提取及鑒定血清外泌體采用SBI公司的外泌體提取試劑盒進行試劑提取，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。將提取到的外泌體樣品染色后置于電鏡下，觀察其顆粒形態。外泌體顆粒濃度采用Nanosight NS300儀進行檢測，將樣品稀釋5000、10 000或20 000倍，使其濃度介于108～109/ml，檢測時Nanosight NS300儀的閾值為5，各檢測參數在檢測過程中保持不變。

1.3.2 外泌體中miRNA-184的檢測將外泌體樣品應用Trizol試劑裂解后提取總RNA，經硅膠模吸附柱純化后行逆轉錄（反應條件：16℃15 min，42℃60 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min），獲得cDNA樣品。采用熒光染料參入法（SYBR Green）對外泌體中miRNA-184進行定量檢測。采用相對定量法，應用2-△△Ct方法計算外泌體中 miRNA-184 表達水平，以miRNA-39作為外參基因（加入trizol裂解后迅速加入秀麗線蟲miRNA-39），?Ct=CtmiRNA-184-CtmiRNA-39。

1.4 觀察指標

比較NSCLC、肺炎患者與健康體檢者的血清外泌體miRNA-184的表達情況，并分析不同臨床特征的NSCLC患者的血清外泌體miRNA-184的表達情況，以及血清外泌體miRNA-184在NSCLC中的診斷效能。

1.5 統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件分析數據。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價血清外泌體miRNA-184在NSCLC中的診斷效能。P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清外泌體的鑒定

電鏡下觀察染色后的外泌體樣品，視野內可見具有脂質雙層膜囊狀、直徑約為200 nm的圓形顆粒（圖1）。Nanosight檢測結果顯示，樣品中顆粒分散均勻，主要分布于直徑35～190 nm，直徑呈單峰正態分布曲線（峰值約為54 nm處）（圖2）。

2.2 血清外泌體miRNA-184的表達情況

圖1 電鏡下外泌體顆粒形態（磷鎢酸染色，×50 000）

圖2 Nanosight檢測血清外泌體濃度與熒光強度圖

NSCLC、肺炎患者及健康體檢者的血清外泌體miRNA-184的表達水平比較，差異有統計學意義（F=10.207，P﹤0.05）；NSCLC患者血清外泌體miRNA-184表達水平明顯高于肺炎患者和健康體檢者（t=6.332、4.810，P﹤0.01）（圖 3）。進一步分析不同臨床特征的NSCLC患者的血清外泌體miRNA-184的表達情況，結果發現TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的NSCLC患者的血清外泌體miRNA-184相對表達量分別為（1.51±0.17）和（1.46±0.11），均明顯高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移患者的（1.07±0.13）和（1.01±0.16），差異均有統計學意義（t=11.342、12.730，P﹤0.01）；病理類型為腺癌與鱗癌的NSCLC患者的血清外泌體miRNA-184相對表達量分別為（1.19±0.21）和（1.25±0.10），兩者比較，差異無統計學意義（P﹥0.05）。

2.3 血清外泌體miRNA-184在NSCLC中的診斷效能

圖3 3組血清外泌體miRNA-184的表達情況

采用ROC曲線評價血清外泌體miRNA-184在NSCLC中的診斷效能，曲線下面積為0.915（95%CI：0.84～0.99），miRNA-184最佳的相對表達量臨界值為1.26，診斷的靈敏度為77.4%，特異度為96.8%。（圖 4）

3 討論

圖4 血清外泌體miRNA-184診斷NSCLC的ROC曲線

近年來，隨著臨床對NSCLC診斷標志物的不斷研究，miRNA受到越來越多的關注，成為腫瘤生物標志物研究的新領域之一[7]。盡管手術聯合同步放化療可提高早期NSCLC的臨床治愈率，但對于晚期患者尚缺乏有效的治療方法[8]。因此，探尋早期NSCLC診斷標志物具有重要的臨床意義。研究表明，miRNA-449、miRNA-142、miRNA-34a和miRNA-29b等與NSCLC的發生發展有關[9]。雖然miRNA對NSCLC的早期診斷具有一定的價值，但多數研究基于腫瘤組織或細胞miRNA的表達差異，在獲得檢測miRNA的腫瘤組織時需行穿刺或有創手術等，因此，此種檢測方式不便于臨床NSCLC的廣泛篩查。以往的研究顯示，人體血液、唾液、尿液中均可檢測到miRNA，且外周血miRNA作為腫瘤標志物已取得一定的效果[10]。季禹喬等[11]的研究顯示，血清miRNA-21在早期NSCLC中具有較高的診斷效能，miRNA-21在NSCLC患者血清中高表達。吳偉東等[12]的研究顯示，miRNA-506診斷NSCLC的靈敏度為81.10%，特異度為86.90%，有助于臨床對NSCLC患者病情的診斷。最近的研究顯示，血清miRNA對早期NSCLC的臨床診斷具有一定的參考價值[13]。以上研究結果說明，血清miRNA有望成為NSCLC的診斷標志物，但由于血清成分復雜，可能導致miRNA來源不明，從而對檢測結果產生一定的影響。資料顯示，miRNA在血清外泌體內穩定存在，其成分沒有血清復雜，且樣本可通過無創方式獲得，這使血清外泌體miRNA具備了成為無創、可靠的腫瘤生物標志物的條件[14]。本研究結果表明，純化的血清樣品中含有大量的外泌體顆粒，并且具備既往報道的外泌體特性。

miRNA為高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，以多種形式存在于動植物及病毒中。近年來有學者報道，外泌體中miRNA分子與血液中總的miRNA分子表達譜具有明顯差異[15]。本研究發現，NSCLC患者血清外泌體miRNA-184表達水平明顯高于肺炎患者和健康體檢者，進一步采用ROC曲線評價血清外泌體miRNA-184在NSCLC中的診斷效能，ROC曲線下面積為0.915（95%CI：0.84～0.99），診斷的靈敏度為77.4%，特異度為96.8%，提示血清外泌體miRNA-184對NSCLC的診斷效能較高。Shen等[16]的研究顯示，血清外泌體miRNA-21對早期NSCLC的診斷具有一定的價值，或將成為肺癌輔助診斷標志物。另有學者研究報道，血清外泌體miRNA-146a-5p水平對預測NSCLC的治療效果具有重要的作用[17]。這說明血清外泌體miRNA與NSCLC的發生發展密切相關，其或將成為早期NSCLC的一個非侵入性診斷標志物。

綜上所述，miRNA-184在NSCLC患者血清外泌體中高表達，且對NSCLC的診斷效能較高，可能成為NSCLC的一個新的診斷標志物。后續需要加大樣本量的收集，進一步探討血清外泌體miRNA與NSCLC的相關性，為NSCLC臨床早期診斷及治療提供參考依據。