PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達與食管癌淋巴結轉移的關系△

張小三，張一鳴，趙燕，戚春暉，楊樹軍#

1鄭州大學附屬腫瘤醫院/河南省腫瘤醫院內科，鄭州 450008

2鄭州第七人民醫院兒科，鄭州 450006 00

食管癌是消化系統常見的惡性腫瘤，預后較差，轉移較早，早期癥狀不明顯，大部分患者就診時已出現了淋巴結轉移[1]，因此，探究早預防、早發現、早治療的方法成為食管癌相關科研工作中需要不斷探索的課題。研究表明，磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）信號轉導通路能夠通過影響下游多種分子的活化狀態而對腫瘤細胞的增殖和凋亡進行調節[2]。也有研究報道稱PI3K/AKT信號通路與腫瘤微淋巴管的形成和淋巴結轉移密切相關[3]。但是，關于PI3K/AKT信號通路相關蛋白在食管癌組織中的表達情況與淋巴結轉移關系的相關研究目前尚未見報道。微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD）指的是單位視野中微淋巴管的數量。有研究顯示，在胃癌組織中，LMVD是淋巴結轉移的重要因素，即LMVD的增加有利于胃癌的淋巴結轉移，分析其原因可能是因為微淋巴管數量的增加使腫瘤和淋巴管內皮接觸的面積增大，從而促使腫瘤細胞更容易進入淋巴管發生淋巴結轉移[4]。本研究通過免疫組織化學法檢測PI3K和AKT蛋白在食管癌組織中的表達情況，并分析PI3K和AKT蛋白表達與食管癌患者臨床特征以及LMVD的關系，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年4月至2018年2月鄭州大學附屬腫瘤醫院/河南省腫瘤醫院收治的術后經病理學檢查證實為食管癌的120例患者的組織標本。納入標準：①經病理組織學檢查證實為食管癌；②術前未行靶向治療、放療、化療或者免疫治療。排除標準：①合并嚴重的心、肺疾病；②術前行新輔助放化療、靶向治療。120例食管癌患者中，男70例，女50例；年齡40～79歲，平均年齡為（48.87±9.45）歲；按照國際抗癌聯盟TNM分期第8版[5]：Ⅰ+Ⅱ期64例，Ⅲ+Ⅳ期56例；組織分化程度：高分化40例，中分化50例，低分化30例；有淋巴結轉移68例，無淋巴結轉移52例。同時收集上述患者癌旁（距腫瘤邊緣﹥2 cm）經病理學檢查證實的120例食管正常黏膜組織標本作為對照。患者及家屬均對本研究知情同意并簽署知情同意書，本研究經過醫院醫學倫理委員會審查通過。

1.2 主要抗體和試劑盒

兔抗人PI3K多克隆抗體、兔抗人AKT多克隆抗體、D2-40單克隆抗體均購自北京奧維亞生物技術有限公司，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒、免疫組織化學試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學染色方法

對所有組織標本采用10%中性福爾馬林溶液固定，常規取材，石蠟包埋。后將蠟塊進行切片，置入40%的乙醇中，然后置于40℃水浴鍋中水浴4 min，進行展開，然后置于60℃烘箱內烘干。采用二甲苯脫蠟20 min，然后采用梯度乙醇進行水化，對PI3K、AKT、D2-40蛋白進行高溫高壓組織修復，然后加入3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）進行沖洗，加入5%羊血孵育30 min，除去封閉液，加入一抗，置于4℃冰箱過夜，PBS沖洗，DAB顯色，然后使用PBS沖洗終止顯色，使用自來水沖洗，鹽酸乙醇分化，乙醇脫水干燥。對PI3K和AKT蛋白表達情況進行判定。

1.4 判定標準

1.4.1 PI 3 K和AKT陽性判定標準[6]PI3K和AKT蛋白均表達于細胞質，陽性染色結果表現為細胞內出現棕黃色顆粒。采用染色強度和陽性細胞所占百分比兩項評分總分判定PI3K和AKT蛋白是否陽性表達。依據染色強度評分：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。依據陽性細胞所占百分比評分：陽性細胞﹤10%記為0分；陽性細胞所占百分比為10%～20%記為1分；陽性細胞所占百分比為21%～50%記為2分；陽性細胞所占百分比﹥50%記為3分。最終得分為染色強度和陽性細胞所占百分比評分之和，﹥2分為陽性表達，≤2分為陰性表達。

1.4.2 LMVD計數標準[7]D2-40表達定位于淋巴管內皮細胞，呈棕黃色或棕褐色顆粒，先在低倍鏡下選取微淋巴管染色豐富的區域，然后在高倍鏡下每個區域中選取5個視野（每個視野0.16 mm2）分別計算微淋巴管數目，取平均值作為LMVD。含有平滑肌或﹥8個內皮細胞的管腔及未染色的管腔均不記數。

1.5 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中PI 3 K和AKT蛋白表達情況的比較

食管癌組織中PI3K和AKT蛋白的陽性表達率分別為85.0%（102/120）和86.7%（104/120），均明顯高于癌旁食管正常黏膜組織中的4.2%（5/120）和5.8%（7/120），差異均有統計學意義（χ2=158.679、157.704，P﹤0.01）。（表1、圖1）

表1 食管癌組織和癌旁食管正常黏膜組織中PI 3 K和AKT蛋白的表達情況[ n（%）]

圖1 PI 3 K和AKT在食管癌組織和癌旁食管正常黏膜組織中的表達情況（免疫組化染色，×200）

2.2 食管癌組織中PI 3 K和AKT蛋白表達情況與食管癌患者臨床特征的關系

不同性別、組織分化程度食管癌患者食管癌組織中PI3K、AKT蛋白的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）；有淋巴結轉移、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期食管癌患者的食管癌組織中PI3K蛋白的陽性表達率均明顯高于無淋巴轉移、TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的食管癌患者，差異均有統計學意義（χ2=10.232、10.756，P﹤0.01）。有淋巴結轉移、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的食管癌患者食管癌組織中AKT蛋白的陽性表達率均高于無淋巴轉移、TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的食管癌患者，差異均有統計學意義（χ2=10.809、5.781，P﹤0.05）。（表2）

2.3 食管癌組織中LMVD與PI 3 K、AKT蛋白表達的關系

PI3K蛋白陽性表達食管癌組織中LMVD為（13.92±3.02），明顯高于PI3K蛋白陰性表達食管癌組織的（6.54±1.05），差異有統計學意義（t=10.228，P﹤0.01）；AKT蛋白陽性表達食管癌組織中LMVD的數量為（13.84±3.08），明顯高于AKT蛋白陰性表達食管癌組織的（6.14±0.89），差異有統計學意義（t=9.904，P﹤0.01）。

表2 不同臨床特征食管癌患者食管癌組織中PI 3 K、AKT蛋白的陽性表達情況（ n=120）

3 討論

作為世界上高發的惡性腫瘤之一，食管癌在中國腫瘤發病率中排名第5位，病死率中排名第4位，隨著人們生活節奏的不斷加快，飲食不規律的現象逐漸增多，因此，食管癌的發病率也呈逐年增加態勢。并且，因早期食管癌的臨床癥狀不明顯，患者往往于就診時已出現淋巴結轉移，大大增加了患者的病死率[8]。

PI3K是一種胞內的磷脂酰肌醇激酶，參與多種生長因子的活化；AKT作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能夠直接對多種轉錄因子進行磷酸化，從而參與生命活動的調節進程[9]。研究表明，PI3K/AKT信號通路不僅參與腫瘤細胞增殖和凋亡的調節，還與腫瘤微淋巴管的生成和侵襲密切相關[10]，目前已經成為了腫瘤靶向治療研究的熱點。相關研究發現，PI3K在乳腺癌組織中的陽性表達率高于癌旁組織，且PI3K的表達與TNM分期、腫瘤大小密切相關，而與患者的年齡無關[9]。Yamamoto等[11]研究發現，在肝癌細胞中，PI3K/AKT信號通路激活抑制了細胞周期蛋白的降解，促進了G0期細胞進入DNA合成期（S期），從而促進了肝癌細胞的異常增殖。本研究采用免疫組織化學法檢測食管癌和癌旁正常黏膜組織中PI3K和AKT蛋白的表達情況，結果顯示，食管癌組織中PI3K和AKT蛋白的陽性表達率均明顯高于癌旁食管正常黏膜組織（P﹤0.01），提示PI3K/AKT信號通路在食管癌的發生過程中起著重要的作用。

有研究表明，PI3K/AKT信號通路能夠直接或間接地促進腫瘤新生血管的生成，在惡性腫瘤轉移的進程中發揮著極其重要的作用[12]。也有研究認為PI3K/AKT信號通路參與了淋巴管的生成，從而參與了腫瘤淋巴結的轉移進程[13]。本研究發現，PI3K/AKT信號通路相關蛋白陽性表達食管癌組織中的LMVD分別高于PI3K/AKT信號通路相關蛋白陰性表達食管癌組織，推測PI3K/AKT信號通路相關蛋白在食管癌淋巴管的生成方面可能起著關鍵作用；同時研究還發現有淋巴結轉移食管癌患者食管癌組織中的PI3K/AKT信號通路相關蛋白陽性表達率均高于無淋巴結轉移的食管癌患者（P﹤0.05），TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期食管癌組織中的PI3K/AKT信號通路相關蛋白陽性表達率均高于TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的食管癌患者（P﹤0.05），推測PI3K/AKT信號通路相關蛋白在促進食管癌的淋巴結轉移方面也起著至關重要的作用。

綜上所述，PI3K/AKT信號通路相關蛋白在食管癌發生和淋巴結轉移過程中均起著至關重要的作用，阻斷該信號通路的某一環節，可能成為食管癌的新的治療靶點。