膀胱癌組織MFN 2、Bmi- 1蛋白表達及臨床意義分析

韓志興，趙玉千，劉慶軍，紀世琪，張海建

首都醫科大學附屬北京地壇醫院泌尿外科，北京100015 0

流行病學研究表明，中國部分地區膀胱癌的發病率具有明顯上升趨勢[1]。臨床上膀胱癌的發生，能夠導致患者總體生活水平下降[2-3]。在探討膀胱癌病情進展的相關生物學機制的過程中，可以發現不同的細胞因子的改變，能夠通過影響信號通路的激活干預腫瘤細胞的能量代謝等過程，進而促進膀胱癌的病情進展。線粒體融合蛋白2（mitofusion 2，MFN2）的表達上調，能夠促進線粒體膜的融合，抑制腫瘤細胞的能量合成和代謝，進而抑制上皮細胞的增殖，促進上皮細胞的凋亡[4]；Bmi-1是多巰基家族相關成員，其能夠通過影響腫瘤細胞的細胞核DNA末端端粒結構的穩定性，促進腫瘤細胞持續性增殖，并能夠引起腫瘤細胞的分化障礙[5]。為了進一步揭示MFN2、Bmi-1表達與膀胱癌的關系，從而為臨床上膀胱癌患者的診療提供理論基礎，本研究選取了80例膀胱癌組織，探討MFN2、Bmi-1在膀胱癌患者病灶組織中的表達情況，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取

選取2015年1月至2018年1月在首都醫科大學附屬北京地壇醫院保存的膀胱癌組織標本。納入標準：①均經病理學檢查確診為膀胱癌；②術前未行放化療等抗腫瘤治療；③臨床資料保存完整。排除標準：合并有其他惡性腫瘤。根據納入、排除標準，共選取膀胱癌組織80例，另選取正常膀胱組織80例作對照。80例膀胱癌組織所屬患者中，男53例，女27例；年齡為45～78歲，平均年齡為（60.21±8.91）歲。80例正常膀胱組織所屬患者中，男50例，女30例；年齡為43～79歲，平均年齡為（59.41±10.32）歲。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05），具有可比性。

1.2 免疫組化檢測方法

采用石蠟進行連續性切片，脫蠟至水后采用H2O2室溫下孵育10 min。磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min。8%的蛋白粉封閉液（購自南京碧云天生物科技公司），封閉2 h。棄封閉液后加入一抗（兔來源一抗濃度1∶1000，4℃冰箱過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min；加入二抗（鼠來源二抗濃度1∶400），室溫孵育20～30 min。磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min。加入辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的標志物，室溫孵育10 min。磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min。滴加顯色劑二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）（購自南京碧云天生物科技公司），復染，脫水，封片。

1.3 結果判斷

MFN2蛋白陽性表現為細胞質出現棕黃色顆粒，Bmi-1蛋白陽性表現為細胞核出現棕黃色顆粒。染色強度：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞比例：﹤26%為1分，26%～50%為2分，﹥50%為3分。根據染色強度和陽性細胞比例之和判定，得分≥3分為陽性表達，﹤3分為陰性表達。

1.4 觀察指標

比較膀胱癌組織和正常膀胱組織中MFN2、Bmi-1蛋白的表達情況，分析MFN2、Bmi-1蛋白表達與膀胱癌患者臨床特征的關系，膀胱癌組織MFN2蛋白與Bmi-1蛋白表達的相關性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件分析數據。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman秩相關性分析。P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膀胱癌組織與正常膀胱組織中MFN 2、Bmi- 1蛋白陽性表達率比較

膀胱癌組織中MFN2和Bmi-1蛋白的陽性表達率分別為52.50%（42/80）和61.25%（49/80），均高于正常膀胱組織的12.50%（10/80）和17.50%（14/80），差異均有統計學意義（χ2=29.174、32.073，P﹤0.05）。

2.2 不同臨床特征的膀胱癌患者膀胱癌組織中MFN 2、Bmi- 1蛋白陽性表達率比較

TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者膀胱癌組織中MFN2蛋白的陽性表達率明顯高于TNM分期為Ⅲ期的患者（χ2=15.402，P﹤0.01）；不同年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移情況的患者膀胱癌組織中MFN2蛋白的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）。腫瘤直徑﹥3 cm、TNM分期為Ⅲ期的患者膀胱癌組織中Bmi-1蛋白的陽性表達率均明顯高于腫瘤直徑≤3 cm、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者（χ2=19.771、10.963，P﹤0.01）；不同年齡、性別、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移情況的患者膀胱癌組織中Bmi-1蛋白的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）。（表1）

2.3 膀胱癌組織中MFN 2與Bmi- 1蛋白表達的相關性分析

表1 不同臨床特征的膀胱癌患者膀胱癌組織中MFN 2、Bmi- 1蛋白陽性表達情況（ n=80）

經Spearman秩相關性分析，膀胱癌組織中MFN2蛋白表達與Bmi-1蛋白表達呈負相關（r=-0.602，P﹤0.01）。（表2）

3 討論

膀胱上皮細胞惡性腫瘤的發生主要考慮與長期吸煙導致的上皮細胞惡性病變，或者家族性遺傳易感基因的攜帶有關。膀胱癌的發生發展，能夠導致患者高腫瘤臨床負荷的出現，增加了患者近期病情進展的風險[6-7]?，F階段臨床上缺乏對膀胱癌早期診斷的可靠的血清學腫瘤指標，而本研究對于相關患者體內MFN2、Bmi-1表達的分析研究，不僅能夠揭示膀胱癌的發生發展機制，還能夠為臨床上膀胱癌血清學腫瘤指標的診斷提供參考。

表2 膀胱癌組織中MFN2與Bmi-1蛋白的表達情況（n=80）

MFN2不僅能夠通過降低鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）酶的活性降低上皮腫瘤細胞對腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）能量利用的能力，抑制腫瘤細胞的增殖，還能夠通過影響核基因轉錄上游的轉錄盒的開放閱讀程度，降低轉錄激活程度，進而降低膀胱上皮細胞核基因異常突變和轉錄的風險。Bmi-1是多巰基相關蛋白，能夠通過對腫瘤細胞表面配體蛋白末端結構的巰基化修飾作用，提高腫瘤干細胞持續性自我擴增的能力。Bmi-1的表達上調能夠導致腫瘤細胞干性特征的顯著增強，促進腫瘤細胞的復發和轉移等病理過程。Bmi-1的表達上調能夠影響端粒酶的活性及其結構的穩定性，導致腫瘤細胞增殖負性調控障礙。

本研究探討了MFN2和Bmi-1在膀胱癌患者中的表達情況，發現在膀胱癌組織中MFN2和Bmi-1的陽性表達率均明顯上調，提示MFN2和Bmi-1陽性表達均能夠參與膀胱癌的病情進展過程。這主要與MFN2和Bmi-1的下列兩個方面的作用機制有關：①MFN2表達上調，主要是由于腫瘤細胞異常增殖過程中線粒體融合程度增加，導致MFN2的反應性升高；②Bmi-1表達上調，主要是由于腫瘤細胞端粒酶活性改變，影響多巰基化修飾過程。白云等[8]也認為，在膀胱癌患者病灶組織中MFN2的表達水平明顯升高，特別是在膀胱癌遠期生存預后較差的患者中MFN2的表達水平可進一步的上升。免疫組化染色分析研究可見，MFN2和Bmi-1的表達主要定位于腫瘤細胞間質成分，推測MFN2和Bmi-1的表達能夠影響腫瘤細胞間信號通路的傳遞或者腫瘤細胞膜內相關因子的激活，進而發揮其病理性作用。在探討MFN2和Bmi-1的表達與膀胱癌患者臨床特征的關系過程中，可以發現在臨床分期較早的患者中，MFN2蛋白的陽性表達率較高，這主要是由于MFN2表達能夠調控腫瘤細胞線粒體酶的穩定性，抑制因線粒體酶的過度激活導致的腫瘤細胞的浸潤和轉移。但本研究并未發現MFN2的表達與膀胱癌患者淋巴結轉移或者分化程度的關系，提示MFN2的表達并不能影響腫瘤細胞的分化程度或者對淋巴結組織的黏附能力；在臨床分期較晚或者腫瘤病灶直徑較大的患者中，Bmi-1蛋白的陽性表達率較高，提示Bmi-1蛋白的表達與膀胱癌患者的臨床特征有關，這主要是由于Bmi-1的表達能夠提高腫瘤細胞的浸潤程度，促進腫瘤細胞的轉移，進而提高膀胱癌的臨床分期。最后，本研究還發現，膀胱癌組織中MFN2、Bmi-1蛋白表達呈負相關，提示二者在促進膀胱癌病情進展的過程中可能發揮了一定的作用。

綜上所述，膀胱癌患者的MFN2、Bmi-1蛋白的陽性表達率均明顯升高，同時MFN2蛋白陽性表達情況與TNM分期有關，Bmi-1蛋白陽性表達情況與腫瘤直徑、TNM分期有關。后續臨床相關研究可以探討MFN2、Bmi-1的表達與膀胱癌臨床預后的關系。