替米沙坦對ApoE基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化斑塊穩定性的影響

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盡管在冠狀動脈粥樣硬化心臟病的預防和治療方面取得了很大的進展，但仍有很高比例的病人在急性冠狀動脈事件中突然死亡[1]。研究表明，冠狀動脈粥樣硬化斑塊的破裂和隨后的血栓形成占急性冠狀動脈事件的70%。易于破裂的動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊被稱為易損斑塊[2]，因此，穩定易損斑塊是冠心病治療的重點。臨床研究顯示，不管是通過血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)類或是血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)類藥物抑制腎素-血管緊張素系統(RAS)都可以減少冠心病病人的發病率和死亡率[3]。并且實驗研究證實，ACEI類或是ARB類藥物都可以抑制動脈硬化病變[4]。但其是否可以穩定動脈粥樣硬化斑塊，相關研究有限。因此，本研究的目的是確定替米沙坦是否具有穩定動脈粥樣硬化易損斑塊的作用，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 6～8周齡載脂蛋白E(ApoE)基因敲除小鼠[品系C57BL/6J，購自北京大學醫學部實驗動物中心(美國Jackson實驗室引進并培育)]32只，雌雄各半，體重18～20 g。

1.1.2 藥物及配制 替米沙坦商品名美卡素，由上海勃林格殷格翰藥業有限公司生產，批號為J20090089。阿托伐他汀商品名立普妥，由輝瑞制藥有限公司生產，批號為H20051409。

1.1.3 試劑與儀器 抗鼠平滑肌細胞α肌動蛋白(SMα-actin)購自Neo Markers公司。二步法免疫組化檢測試劑(鼠兔共用通用型二抗)購自DaKo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立、分組及給藥 基礎飼料喂養6～8周后，給小鼠飼以含脂肪21%、膽固醇0.15%的高脂飼料[5](60Coγ滅菌照射處理)13周。確定AS形成后，將小鼠隨機分為3組：替米沙坦組、阿托伐他汀組、對照組，各10只。按成人與小鼠的給藥劑量換算系數折算成小鼠用量[6]：替米沙坦組12.01 mg/(kg·d)，阿托伐他汀組3 mg/(kg·d)，對照組(蒸餾水)。將藥物溶于蒸餾水中，灌胃給藥，每日1次，繼續喂養13周。

1.2.2 標本處理 給藥治療13周后處死全部小鼠，游離主動脈，沿中線縱向切開用于觀察大體病理標本，大體標本進行蘇丹Ⅳ染色。取出心臟，10%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，小鼠心底部橫斷面連續切片。按Suzuki等[7]的方法，每只小鼠主動脈根部取3個相同的切面，分別是：①升主動脈最近端橫截面；②主動脈瓣起始橫截面；③主動脈瓣完全出現并匯合在一起。每只小鼠各取上述3個切面的切片分別進行HE染色、Movat染色和免疫組化染色，光鏡下觀察。每個樣本的所用形態學觀察指標的計算均取3個切面的平均值進行較全面的綜合評價。

1.2.3 病理染色

1.2.3.1 HE染色 HE染色主要觀察斑塊內細胞外脂質(extracellular lipids，EL)成分(主要是膽固醇結晶和膽固醇酯)。

1.2.3.2 Movat五色套染法 采用改良的Movat五色套染法[8]，染色結果為：細胞核及彈力纖維為黑色；基質和黏蛋白為藍色；膠原纖維為黃色；平滑肌為紅色；泡沫細胞(foam cells，FC)為淡紫色。主要觀察斑塊內泡沫細胞、膠原成分。

1.2.3.3 免疫組化染色 免疫組化染色檢測主動脈根部動脈粥樣斑塊內SMα-actin。采用Envision兩步法免疫組化染色，切片脫蠟，0.3%H2O2室溫15 min滅活內源性過氧化物酶；滴加一抗(1∶300稀釋)4 ℃過夜；滴加通用型二抗，室溫孵育1～2 h；TAB顯色。

1.2.4 檢測指標

1.2.4.1 大體標本 將染色后的大體標本在放大6倍的體視顯微鏡下拍照，并使用圖像分析軟件(Image-ProPlus 5.1)測量血管內膜上的斑塊面積和內膜總面積，并計算斑塊/內膜面積的比值。

1.2.4.2 主動脈根部橫切片 切片在×40倍普通光鏡下，利用病理組織實時攝像顯微鏡系統攝像。采用圖像分析軟件測量每個切片的管腔面積和內彈力膜圍繞面積，后者減去前者即為動脈粥樣硬化斑塊面積。校正后斑塊面積即斑塊面積除以內彈力膜圍繞面積。同時采用該軟件測量并計算細胞外脂質、泡沫細胞、膠原面積(collagen area，CA)成分各自占斑塊面積的百分比，并結合免疫組化染色測量斑塊內平滑肌細胞(SMC)陽性面積占斑塊面積的百分比，最后采用易損指數(vulnerablility index，VI)[9]綜合評價藥物對小鼠主動脈斑塊穩定性的影響。每個樣本取3個切面的平均值。計算公式為：VI=(EL+FC)/(CA+SMC)，每個樣本取上述指定的3個切面的平均值。

1.2.4.3 血脂測定 于實驗結束時采血，采血前12 h禁食水，眶下靜脈取血，離心分離血清。總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride， TG)用酶法測定，高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol， HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol， LDL-C)用免疫比濁法測定。

2 結 果

2.1 病理觀察

2.1.1 大體標本 各組小鼠主動脈管壁均明顯增厚、粗糙，管壁上可見一些紅染呈斑塊樣突起，大小不等，散在或融合成片，詳見圖1。干預后，替米沙坦組及阿托伐他汀組小鼠主動脈斑塊/內膜面積比值分別為28%、22%，均明顯低于對照組的36%，差異有統計學意義(P<0.05)，提示經過藥物干預后粥樣硬化病變累及范圍有所降低；但替米沙坦組和阿托伐他汀組之間差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖2。

圖1 ApoE基因敲除小鼠主動脈大體標本(蘇丹Ⅵ染色)

與對照組比較，＊ P<0.05圖2 各組ApoE基因敲除小鼠主動脈大體標本斑塊面積的比較

2.1.2 HE染色和Movat五色套染法觀察斑塊內部成分 如圖1、圖3～圖6所示，光鏡下對照組及各藥物干預組小鼠主動脈根部可見明顯的動脈粥樣硬化斑塊，顯示出易損斑塊特征。Movat五色套染法染色后，光鏡下模型組及各藥物干預組小鼠主動脈根部內皮細胞下可見淡紫色泡沫細胞，斑塊纖維帽被泡沫細胞覆蓋，彈力纖維變性、斷裂、變薄、甚至消失，血管三層結構破壞。對于主動脈根部橫切面動脈粥樣硬化斑塊面積，替米沙坦組與對照組比較差異無統計學意義，阿托伐他汀組較對照組減少了23%(P<0.05)，但校正后斑塊面積各組之間差異無統計學意義，詳見圖7、圖8。

圖3 ApoE基因敲除小鼠主動脈根部橫切面HE染色(×10)

圖4 ApoE基因敲除小鼠主動脈根部橫切面HE染色(×40)

圖5 ApoE基因敲除小鼠主動脈根部橫切面Movat染色(×40)

圖6 ApoE基因敲除小鼠主動脈根部橫切面平滑肌免疫組化染色(×40)

與對照組比較，＊ P<0.05圖7 各組ApoE基因敲除小鼠主動脈根部橫切面斑塊面積比較

圖8 各組ApoE基因敲除小鼠校正后主動脈根部橫切面斑塊面積比較

2.2 主動脈斑塊內部成分改善情況 給藥13周后，替米沙坦組和阿托伐他汀組小鼠動脈斑塊易損指數分別為1.12和0.91，均低于對照組的2.67(P<0.05)。

詳見圖9、圖10。

與對照組比較，＊P<0.05，#P<0.01圖9 各組ApoE基因敲除小鼠主動脈斑塊成分所占面積比較

與對照組比較，＊P<0.05圖10 各組ApoE基因敲除小鼠易損指數比較

2.3 血脂的測定 與對照組比較，阿托伐他汀組TC和LDL-C水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

表1 各組ApoE基因敲除小鼠血脂水平比較(±s) mmol/L

與對照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

一些臨床研究顯示，ARB或ACEI類藥物不僅能夠降低血壓，同時能夠減少病人心血管事件，并且與藥物本身的降壓作用無關[10-12]。這是因為RAS系統在動脈粥樣硬化斑塊形成和發展中起著重要作用，因此ARB類藥物作為抗動脈粥樣硬化藥得到了廣泛應用[13-14]。目前的研究表明，斑塊的穩定性主要取決于斑塊內組織成分以及纖維帽的狀態[14]。纖維帽主要是由平滑肌細胞和膠原構成[14]。而巨噬細胞分泌基質金屬蛋白酶(MMPs)和γ-干擾素，最終使斑塊纖維帽變薄，易于破裂[15]。因此，將脂質成分(泡沫細胞和細胞外脂質)與纖維肌性成分(平滑肌細胞和膠原纖維)共同作為衡量斑塊的易損指數[9]，可作為反映斑塊易損性的更為客觀、全面的評價指標。本研究結果表明，與對照組相比，替米沙坦組及阿托伐他汀組小鼠主動脈斑塊易損指數均顯著降低(P<0.05)。替米沙坦組可降低泡沫細胞含量，增加膠原和平滑肌，使得易損指數下降。阿托伐他汀組可降低細胞外脂質，增加膠原和平滑肌，也使易損指數下降。因此，替米沙坦和阿托伐他汀都可以穩定動脈粥樣硬化斑塊。

根據本實驗結果，替米沙坦對血脂水平和細胞外脂質面積的影響并不顯著，但可以明顯減少泡沫細胞。泡沫細胞來源于巨噬細胞，巨噬細胞通過內吞低密度脂蛋白轉化成泡沫細胞。研究顯示巨噬細胞在動脈粥樣硬化的所有階段都具有重要功能，包括斑塊破裂的過程。因此，推測替米沙坦促進斑塊穩定性的可能機制是抑制動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞。這與目前的研究結果相一致，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)激活后血管緊張素作用于血管壁AT1受體從而促進動脈粥樣硬化的發生和發展，在動脈粥樣硬化時AT1受體表達增多并通過單核細胞趨化蛋白促進單核/巨噬細胞聚集，還可促進平滑肌細胞移行和增殖而參與動脈粥樣硬化的發展[16]。而替米沙坦作為一種高選擇性AT1受體拮抗劑，可減少單核/巨噬細胞的聚集，提示其在延緩或穩定動脈粥樣硬化斑塊方面有重要作用。

綜上所述，本研究表明，使用替米沙坦可以有效地延緩動脈粥樣硬化的進展，并通過改變斑塊的組成促進ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊的穩定性。在此基礎上，深入研究替米沙坦穩定動脈粥樣硬化易損斑塊的機制，對于進一步提高穩定斑塊作用，減少臨床急性心血管事件的發生具有重要意義。