七氟醚預處理對高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷的保護作用

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近年來，糖尿病的發病率逐年增高，血管并發癥是糖尿病致死致殘的主要原因。而血管內皮功能損傷是糖尿病血管病變發生的始動因素和主要病理生理學基礎，甚至在尚未出現慢性血管并發癥的糖尿病病人已出現內皮功能明顯降低。高血糖可以通過多種機制損傷血管內皮細胞功能，如氧化應激、炎癥、蛋白質非酶糖基化、繼發性脂代謝紊亂等[1]。近期研究發現新型麻醉藥七氟醚有心血管保護作用。本研究對體外培養的人臍靜脈內皮細胞(HUVECS)進行高濃度葡萄糖處理，模擬糖尿病體內環境，通過檢測細胞凋亡率觀察內皮細胞的損傷情況及七氟醚對受損內皮細胞的保護作用，并從細胞增殖、凋亡與抗凋亡以及內皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達改變及超氧化物歧化酶(SOD)抗氧化等多個角度探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 細胞培養試劑均購自Gibco公司，人臍靜脈內皮細胞由山西醫科大學第一醫院提供，七氟醚免疫細胞化學試劑盒購自博士德公司。

1.2 原代人臍靜脈內皮細胞鑒定 人臍靜脈內皮細胞培養在含10%胎牛血清RPMI1640培養基中，37 ℃，5%CO2培養。人臍靜脈內皮細胞密度達到70%左右時在倒置顯微鏡下攝片觀察細胞形態，用兔抗人Ⅷ因子相關抗原(Ⅷ因子RAg)多克隆抗體進行。

1.3 實驗分組 人臍靜脈內皮細胞生長至70%～80%融合時，分為4組：正常糖濃度組(A組，5.5 mmol/L葡萄糖)、高葡萄糖組(B組，25 mmol/L葡萄糖)、甘露醇組(C組，5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)、高葡萄糖(25 mmol/L葡萄糖)+七氟醚組(D組)。處理72 h后用于后續實驗。

1.4 MTT法檢測各組細胞的存活率 以每孔100 μL(細胞數1×104)將細胞接種于 96孔板，每組12復孔。37 ℃，5%CO2培養48 h后，吸去培養液，每孔加0.1 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)和10 μL MTT溶液，37 ℃，5% CO2條件下培養4～6 h，每孔加0.1 mL二甲基亞砜(DMSO)，酶聯檢測儀測定A570。實驗重復3次。根據以下公式計算各實驗組的存活率：存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)

1.5 流式細胞術碘化丙啶(PI)/Annexin雙染法檢測細胞凋亡 各組細胞胰蛋白酶消化后離心，棄上清，加入200 μL Binding Buffer并重懸細胞，然后加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻，避光室溫反應15 min。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.6 RT-PCR測定細胞中eNOS mRNA的表達 取各組細胞5×106，Trizol一步法分別提取細胞總RNA，取2 μg總RNA用AMV逆轉錄酶進行逆轉錄，PCR擴增eNOS，設計eNOS基因特異引物為F:5′-CTCATGGGCACGGTGATG-3′；R:5′-ACCACGTCAACTCCCATACAC-3′；擴增DNA片段為152 bp，同時擴增人GAPDH作為內參照，GAPDH的基因特異引物為F:5′-AACAGCGACACCATCCTC-3′；R: 5′-CATACCAGGAAATGAGCTTGACAA-3′，擴增DNA片段為85 bp；循環條件:預變性 95 ℃2 min，變性94 ℃1 min，退火55 ℃2 min，延伸72 ℃90 s，循環35次。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察并拍照。BIO RAD Molecular Imager Gel Doc XR 170-8171型紫外凝膠圖像成像分析系統成像，應用Quantity One軟件進行積分吸光度測定及半定量分析，目的基因mRNA 的相對表達水平用IA/ IAβ - actin值來表示。

1.7 ELIAS檢測SOD含量 取細胞各5×104接種于12孔板，每24 h收集培養上清(-70 ℃凍存)，更換新鮮培養液，連續7 d，用SOD SELISA試劑盒檢測培養上清SOD中的活性。具體過程操作步驟按試劑盒說明書進行，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD 活力。

1.8 蛋白免疫印跡 各組細胞分別提取蛋白，BCA定量分別得出樣品蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠，調整蛋白上樣濃度一致，100 V，2 h電泳，隨后按照1.5 A/cm2選擇恒流轉膜1.5～2.0 h。將聚偏二氟乙烯膜(PVDF)浸泡在含5%脫脂奶粉的TBST中，室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，隔天按照說明書比例室溫孵育二抗1～2 h，隨后用凝膠成像儀進行發光并記錄灰度值。

2 結 果

2.1 光鏡下形態學觀察 B組、C組、D組處理72 h后細胞形態均發生不同程度變化，長軸變長，呈梭形者增多。詳見圖1。

圖1 各組內皮細胞光鏡下形態(×400)

2.2 細胞存活率檢測 B組內皮細胞存活率顯著低于A組(P<0.05)，D組細胞存活率較B組顯著增加(P<0.01)，C組與A組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖2。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 A組：常規培養的人臍靜脈內皮細胞早期凋亡率為5.54%，晚期凋亡率為11.01%，細胞死亡率為16.55%。B組：早期凋亡率為6.16%，晚期凋亡率為15.06%，細胞死亡率為21.26%。C組早期凋亡率為12.02%，晚期凋亡率為24.83%，細胞死亡率為36.85%。D組：早期凋亡率為10.68%，晚期凋亡率為36.18%，細胞死亡率為46.86%。B組和D組細胞凋亡率較與A組均有所增加(P<0.05)。詳見圖3。

2.4 RT-PCR測定細胞中eNOS mRNA的表達 灰度分析表明，B組高葡萄糖濃度處理72 h后eNOSmRNA表達量明顯降低，與A組比較差異有統計學意義(P<0.05)；D組eNOSmRNA表達量高于B組(P<0.05)。詳見圖4。

2.5 SOD活性檢測 A組、B組、C組、D組細胞的SOD活性分別為(223.95±4.67) U/mgprot、(229.67±4.56)U/mgprot、(147.12±2.64)U/mgprot、(183.97±4.67)U/mgprot。與B組比較，C組SOD活性明顯降低(P<0.05)，七氟醚處理后SOD有回升趨勢(P<0.05)。詳見圖5。

2.6 Western Blot結果 與A組相比，B組、C組、D組細胞蛋白表達Bax明顯增高，D組是A組的1.3倍，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，B組是A組的1.5倍，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。D組Bcl-2的表達量較其他組明顯降低，是A組的1.8倍，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖6。

3 討 論

在糖尿病病理進程中，血管內皮細胞是高血糖首先破壞的靶點。研究表明，糖尿病病人的血管生理機能、亞細胞結構、生物化學、細胞分子和分子生物學方面的異常都與高血糖導致的血管內皮細胞損傷有關。高血糖導致血管內皮細胞損傷與凋亡，內皮細胞功能失調，血管內皮完整性和血管功能遭到破壞，從而直接引起血管病變的發生。

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.01

圖3 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05

與B組比較，*P<0.01

本研究證實高葡萄糖濃度處理使內皮細胞基因bax轉錄水平提高，使內皮細胞受損傷后盡早啟動凋亡機制，從而引發內皮細胞凋亡。抑制基因bcl-2轉錄水平表達及蛋白表達，使內皮細胞受損傷后抗凋亡能力降低，而易發生損傷后凋亡。而七氟醚通過抑制bax表達，增加bcl-2表達起到抗凋亡作用，保護內皮細胞。這與高糖可導致氧化應激暴發、惡化線粒體功能紊亂并改變膜的特性，線粒體外膜的損傷伴隨著 Bcl-2 蛋白激活導致線粒體外膜通透性改變、釋放細胞色素 C、Caspase 活化和細胞凋亡的報道相一致[2]。高糖可造成細胞內氧化應激增加，過多的氧自由基可以激活p21(ras)-MAPK-NFkB通路，使NF-κB入核，然后造成細胞內調節炎癥因子的表達，促使白細胞穿越和黏附在血管內皮細胞上，造成血管壁的炎癥反應；還可以通過P38MAPK途徑抑制NO的生成，使血管的舒張功能受到影響。有研究觀察了高糖對人臍靜脈內皮細胞凋亡的影響，發現在細胞培養基中加入含有糖基化終末產物(AGEs)的胎牛血清，然后培養6～48 h可使人臍靜脈內皮細胞明顯凋亡。

源自糖尿病病人靜脈內皮細胞中線粒體動力學發生改變，與健康對照相比，糖尿病病人靜脈內皮細胞 Fis1 表達增加，線粒體碎片增多；當培養的人主動脈內皮細胞暴露于 30 mmol 的葡萄糖時也發現類似改變，線粒體網絡減少，Fis1 和 Drp1 表達增加。線粒體動力學的改變與線粒體活性氧簇(ROS)的產生增加、激活內eNOS與環磷酸鳥苷(cGMP)的顯著受損相關；使用 siRNA 沉默 Fis1 和 Drp1，減少了高糖誘導的線粒體網絡改變、ROS 產生、eNOS活化與 cGMP產生。

圖6 Western Blot結果

以上結論表明，線粒體分裂增加參與了糖尿病內皮細胞功能障礙的發生與發展。而高糖可導致細胞的氧化應激，細胞中自由基的特異性清除酶如SOD及過氧化氫酶(POD)是保護機體免受損傷的關鍵酶，本實驗研究表明，七氟醚可提高內皮細胞SOD活性，可能通過SOD的活性增高起到抑制脂質過氧化物的產生，進而保護生物膜的作用。

血管內皮細胞的功能紊亂與內皮細胞的凋亡是糖尿病血管并發癥的重要發病原因，生理條件下 PI3K-AKt 通路與內皮功能活性密切相關：PI3K-AKt 通路可通過磷酸化 Akt 的 Thr308 和 Ser473 兩個位點促進內皮細胞增殖，通過抑制caspase-9 減少內皮細胞凋亡，還可以磷酸化 eNOS 的 Ser1177 位點來促進NO生成[3]。本實驗證實外源性地給予七氟醚處理可以增強pAkt的表達，提示可通過促進PI3K/Akt途徑調節內皮細胞的功能活動。

七氟醚作為繼乙醚、氟烷之后的第三代麻醉吸入藥，有著復雜的藥理學效應和病理生理機制，比如：七氟醚自身是促進炎癥還是抑制炎癥；是促凋亡還是抗凋亡；以及是否能改善術后細胞損傷，尤其是圍術期的副作用都有待進一步實驗研究。