TLR4介導(dǎo)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞自噬在腦出血后炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制研究

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腦出血是指非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血，占全部腦卒中的20%～30%，急性期病死率為30%～40%，發(fā)生的原因主要與腦血管病變有關(guān)[1]。腦出血在我國的發(fā)病率逐年上升，其具有較高的傷殘率，已嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量和生命健康。因此，深入研究腦出血的發(fā)病機(jī)制以及腦出血的新治療靶點具有重要的臨床意義。對于腦出血的機(jī)制研究，多數(shù)研究都是關(guān)注血管內(nèi)皮細(xì)胞，對小膠質(zhì)細(xì)胞的研究較少。目前有少量研究結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的自噬反應(yīng)對腦出血后的炎癥損傷起著非常重要的作用[2]。適當(dāng)激活小膠質(zhì)細(xì)胞時，可促進(jìn)腦損傷的自動修復(fù)，但小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化時，將可能加重?fù)p傷[3]。小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的發(fā)生與腦出血炎癥損傷息息相關(guān)。有少量研究表明，TLR4相關(guān)信號通路，即TLR4/ MyD88/核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)信號通路參與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞自噬、炎癥損傷等多個方面[4]。但關(guān)于TLR4介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞自噬在腦出血炎癥損傷中作用的研究較少。因此，本研究探討TLR4介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬在腦出血后炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 C57BL/6J小鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；二抗購自碧云天公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒均購自坦克拉公司；質(zhì)粒及配套轉(zhuǎn)染配套試劑均購自廣州RiboBio公司。TGL-16G-A型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；7300型實時熒光定量PC電子天平R儀(美國Applied Biosystems公司)；基礎(chǔ)電泳儀(美國Bio-Rad公司)；EL204(上海特勒-托多利多儀器有限公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 原代小膠質(zhì)細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定 C57BL/6小鼠飼養(yǎng)在SPF級動物實驗室，12 h/12 h晝夜循環(huán)光照，溫度為(22±2)℃。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，處死小鼠，迅速進(jìn)行手術(shù)開腦，保留前腦組織，取C57BL/6小鼠前腦組織，研磨后提取分離原代小膠質(zhì)細(xì)胞。加入含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。采用免疫組化鑒定，具體操作參考文獻(xiàn)[5]。

1.2.2 實驗分組

1.2.2.1 分組1 A組：小膠質(zhì)細(xì)胞；B組：小膠質(zhì)細(xì)胞+陰性siRNA轉(zhuǎn)染；C組：小膠質(zhì)細(xì)胞+TLR4-siRNA轉(zhuǎn)染。Q-PCR和Western Blot檢測分組1中TLR4的表達(dá)。

1.2.2.2 分組2 D組：小膠質(zhì)細(xì)胞+等量的對照溶劑(0.9%NaCl)；E組：小膠質(zhì)細(xì)胞+自噬抑制劑(3-MA)；F組：小膠質(zhì)細(xì)胞+control-siRNA+自噬抑制劑(3-MA)；G組：小膠質(zhì)細(xì)胞+TLR4-siRNA+等量的對照溶劑(0.9%NaCl)；H組：小膠質(zhì)細(xì)胞+TLR4-siRNA+自噬抑制劑(3-MA)。Western Blot檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)。

1.2.3 轉(zhuǎn)染及流式鑒定[6]參照GenBank數(shù)據(jù)庫提供的TLR4基因序列，選擇對TLR4基因編碼區(qū)具有干擾效應(yīng)的1個siRNA和陰性對照siRNA。TLR4-siRNA序列正義鏈：5′-UUCGAGACUGGACAAGCCA-3′；反義鏈：5′-UGGcuuGuCcAGucucGAAn-3′，陰性對照siRNA正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGuCACGUTT-3′；反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATI-3′。對于siRNA在小膠質(zhì)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，采用FAM熒光探針標(biāo)記法檢測。按說明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后，采用胰蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行消化，1 000 r/min離心5 min，采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進(jìn)行細(xì)胞洗滌2次，離心，棄上清液，再用PBS吹打細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，稀釋細(xì)胞密度為1×106個/mL，F(xiàn)AM表達(dá)陽性率的檢測采用流式細(xì)胞儀，其FAM表達(dá)陽性率為(93±5)%。

1.2.4 Q-PCR檢測分組1中TLR4的表達(dá) 根據(jù)Trizol試劑盒提取組織總RNA，采用核酸測定儀測定RNA純度和濃度，取1 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，生成cDNA。采用SYBR green染料法進(jìn)行定量檢測，TLR4及GAPDH(內(nèi)參)擴(kuò)增引物序列如下：TLR4上游引物5′-CTGCAGAGCATGGACTCGTC-3′，下游引物5′-CCGTTGAAGAGAGTGGAGTG-3′；GAPDH上游引物5′-CCTAGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3，下游引物5′-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3，擴(kuò)增條件及計算方法參考文獻(xiàn)[7]。

1.2.5 Western Blot檢測分組1中TLR4的表達(dá)[8]常規(guī)方法提取組織總蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)方法測定蛋白質(zhì)含量后進(jìn)行凝膠電泳，每孔上樣20 μg，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯薄膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上后，3%的脫脂奶封閉2 h，分別孵育TLR4(目的蛋白)和GAPDH(內(nèi)參蛋白)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，孵育二抗后顯影。采用Quantityone軟件對條帶亮度進(jìn)行分析。

1.2.6 Western Blot檢測分組2中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、TLR4、MyD88、TRIF和NF-κB蛋白表達(dá) Western Blot操作步驟同1.2.5項，孵育LC3-Ⅱ/Ⅰ、TLR4、MyD88、TRIF和NF-κB(目的蛋白)和GAPDH(內(nèi)參蛋白)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，孵育二抗后顯影。采用Quantityone軟件對條帶亮度進(jìn)行分析。

1.2.7 ELISA檢測分組2中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平 取對數(shù)生長期的小膠質(zhì)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，24 h貼壁后進(jìn)行實驗。實驗分組與給藥方法參照分組2情況，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取細(xì)胞上清液，采用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2 結(jié) 果

2.1 Q-PCR和Western Blot檢測分組1中TLR4的表達(dá)情況 A組和B組TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與B組相比，C組TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1。

與B組相比，*P<0.05圖1 Q-PCR和Western Blot檢測分組1中TLR4的表達(dá)

2.2 Western Blot檢測分組2中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平 D組、E組和F組TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與D組相比，G組TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；H組與F組相比，TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。E組和F組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與F組、G組相比，H組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2。

2.3 ELISA檢測分組2中TNF-α、IL-1β、IL-6情況 E組和F組TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與F組相比，H組TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與G組相比，H組TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

與D組相比，*P<0.05；與F組相比，#P<0.05；與G組相比，△P<0.05圖2 Western Blot檢測分組2中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白水平

與F組相比，1)P<0.05；與G組相比，2)P<0.05

3 討 論

腦出血在我國的發(fā)病率逐年上升，其具有較大的傷殘率，已嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量和生命健康。因此，深入研究腦出血的發(fā)病機(jī)制以及研究腦出血的新治療靶點具有重要的臨床價值和科學(xué)意義。對于腦出血的機(jī)制研究，目前有少量研究結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的自噬反應(yīng)對腦出血后的炎癥損傷起著非常重要的作用[9-11]。適當(dāng)激活小膠質(zhì)細(xì)胞時，可促進(jìn)腦損傷的自動修復(fù)，但小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化時，將可能加重?fù)p傷[12-13]。小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的發(fā)生與腦出血炎癥損傷息息相關(guān)。有研究表明， TLR4與小膠質(zhì)細(xì)胞自噬以及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[14-16]。TLR4是目前研究較多的 TLRs 家族成員。TLR4 在外源性或者內(nèi)源性配體的刺激作用下，主要有兩條信號通路，這兩條信號通路分別是 MyD88 依賴途徑和 MyD88 非依賴途徑。在 MyD88 依賴途徑中，活化的 TLR4 的胞內(nèi)區(qū)與下游 MyD88 的羧基端結(jié)合，激活下游 NIK(NF-κB 誘導(dǎo)激酶)，接著激活下游 IκB，最終激活NF-κB，而NF-κB p65是這條通路的重要蛋白，故 MyD88 依賴途徑即 TLR4/ MyD88/NF-κB 信號通路參與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞自噬、炎癥損傷等多個方面[17-20]。但關(guān)于TLR4介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞自噬在腦出血炎癥損傷中的作用的研究較少。

本研究結(jié)果表明，TLR4受到抑制后，小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TLR4含量顯著降低。給予小膠質(zhì)細(xì)胞自噬抑劑(3-MA)處理后，細(xì)胞內(nèi)TLR4及其下游MyD88、NF-κB p65含量并無明顯變化，而給予TLR4-siRNA+3-MA處理小膠質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)TLR4、MyD88、NF-κB p65及下游相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯降低，說明抑制細(xì)胞內(nèi)TLR4表達(dá)后，可有效阻止下游TLR4/ MyD88/NF-κB 信號通路的信號傳遞和表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞相關(guān)的炎癥損傷。同時，使用自噬抑制劑3-MA后，小膠質(zhì)細(xì)胞自噬水平下降，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低，細(xì)胞自噬相關(guān)信號通路表達(dá)被抑制，減弱細(xì)胞內(nèi)炎性損傷，即細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平亦降低。

綜上所述，TLR4-siRNA可抑制TLR4介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞自噬，從而減輕自噬引起的腦出血炎癥損傷。