糖尿病大鼠心肌梗死后心肌損傷加重與FUNDC1的關系探討

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糖尿病及其引發的各種慢性并發癥嚴重威脅人類健康[1]。心肌梗死是導致糖尿病病人死亡的重要原因。糖尿病是心肌梗死的獨立危險因素，可以加重病人心肌梗死后心肌損傷。有研究表明，自噬在糖尿病及其誘發的心肌梗死等并發癥中發揮了重要作用[2]。自噬是機體的一種防御性機制，能減輕各種應激狀態下的細胞損傷，維持器官正常功能，而抑制自噬會導致細胞損傷[3-4]。FUNDC1是一種特殊的細胞膜表面蛋白，在細胞缺氧時發生去磷酸化，通過特定結構域與LC3-Ⅱ相互作用而啟動自噬，減輕心肌細胞損傷[5]，而敲除小鼠的FUNDC1基因后自噬被抑制，缺血時心肌損傷加重[6]。糖尿病病人心肌梗死后缺血區心肌損傷增強與自噬的關系目前尚不明確。本實驗通過建立糖尿病大鼠心肌梗死模型，觀察自噬小體數量、去磷酸化FUNDC1和自噬相關蛋白LC3-Ⅱ表達的變化，探討糖尿病大鼠心肌梗死后心肌損傷增強與FUNDC1及其介導的自噬的關系。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 清潔健康雄性SD大鼠60只，2～3月齡，體重200～220 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。大鼠適應性飼養1周后，采用隨機數字表法分為假手術組(NS組)、糖尿病+假手術組(DS組)、心肌缺血組(NI組)、糖尿病+心肌缺血組(DI組)，每組15只。

1.2 糖尿病大鼠模型建立 DS組和DI組參照文獻[7]中的方法構建大鼠糖尿病模型。大鼠禁食不禁水10 h后腹腔注射1%鏈脲佐菌素(批號：S0130，Sigma，美國)60 mg/kg，普通動物飼料喂養72 h后尾靜脈采血測量空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L，并出現多飲、多尿、多食和體重減輕，提示建模成功。實驗動物同步普通動物飼料喂養8周，期間不進行胰島素干預，觀察其行為表現，定時測量血糖。

1.3 心肌梗死模型建立 術前禁食不禁飲12 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液3.5 mL/kg，麻醉后仰臥固定于保溫工作臺上，連接BL-410生物機能實驗系統監測心電圖。經頸正中切口暴露氣管，T形切口氣管插管后連接ALC-V8動物呼吸機(上海奧爾特生物科技有限公司)機械通氣，設置潮氣量8～10 mL，通氣頻率60次/min，吸呼比1∶2。參照文獻[8]中的方法，NI組和DI組大鼠經胸骨左緣第4、5肋間沿肋骨切開暴露心臟，用7-0絲線于左心耳下穿過冠狀動脈左前降支(LAD)，絲線兩端穿過一細硅膠套管，收緊套管并持續固定造成結扎區域缺血，心電圖示ST段抬高，T波倒置，病理性Q波，肉眼觀察結扎區域心肌顏色蒼白，表明心肌梗死模型成功。NS組和DS組只穿線不接扎。

1.4 心肌梗死面積測定(TTC染色法) 心肌梗死6 h后每組隨機抽取5只大鼠，經股靜脈逆行注入1%伊文氏藍染液3 mL，立即取出心臟，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗后，置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min。后將心臟橫切為5～6個薄片，每片厚2 mm左右，切片迅速置于2%TTC溶液中，37 ℃恒溫孵育15 min，清洗后用4%甲醛溶液固定15 min。可見藍色為正常組織，暗紅色為缺血心肌組織，灰白色為梗死組織。薄片掃描后用ImageProplus5.0圖像分析軟件(Media Cybernetics公司，美國)分析，測定缺血區梗死體積與缺血區心肌組織體積的百分比，反映心肌梗死體積。

1.5 病理及電鏡切片觀察 心肌梗死6 h后，隨機抽取各組部分心肌組織，經石蠟切片制備、脫蠟、染色、脫水、封片后于400倍光學顯微鏡下觀察心肌組織HE染色病理學結果。剩余5只大鼠部分組織切成1 mm×1 mm×1 mm大小，放入戊二醛磷酸鹽和鋨酸中固定，經漂洗、脫水、包埋、切片后，經醋酸雙養鈾與檸檬酸鉛雙重染色，JEM-2100型透射電鏡(×1 500，JEOL公司，日本)下觀察心肌超微結構變化。

1.6 FUNDC與LC3-Ⅱ檢測 取部分組織采用western-blot法測定FUNDC1和LC3-Ⅱ表達水平。按照蛋白提取試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)說明，將大鼠心臟組織打碎后加入細胞裂解液，勻漿離心取上清液，BCA法測定蛋白濃度。根據目的蛋白的分子量配制不同濃度的分離膠與濃縮膠，80 V電壓凝膠電泳90 min，轉膜后取出膜用TBS漂洗一次，用TBST配制5%脫脂牛奶，室溫下搖床封閉1 h，TBST洗涮20 s后分別加入兔抗鼠單克隆去磷酸化FUNDC1抗體(ABclonal，A16318)和 兔抗鼠LC3-Ⅱ抗體(Proteintech，18725-1-AP)，4 ℃孵育過夜。TBST漂洗5 min×3次后加入HRP的山羊抗兔(1∶2 000，武漢博士德生物工程有限公司)二抗，4 ℃孵育2 h后，TBST漂洗3次，每次5 min。取適量ECL試劑盒(BIO-RAD，1705060)中等體積A液和B液混合，加到目的條帶附件避光反應5 min。化學光敏模式曝光顯影。以β-actin為內參，以去磷酸化FUNDC1條帶灰度值與β-actin條帶灰度值之比反映FUNDC1的去磷酸化水平；以LC3-Ⅱ條帶灰度值與β-actin條帶灰度值之比反映 LC3-Ⅱ的表達水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積、去磷酸化FUNDC1、LC3-Ⅱ的比較 與NS組相比，DS組心肌梗死面積差異無統計學意義(P>0.05)，NI組、DI組心肌梗死面積增大(P<0.05)；與DS組相比，NI組、DI組心肌梗死面積增大(P<0.05)；與NI組相比，DI組心肌梗死面積增大(P<0.05)。與NS組相比，DS組FUNDC1去磷酸化差異無統計學意義(P>0.05)，NI組、DI組FUNDC1去磷酸化增多(P<0.05)；與DS組相比，NI組、DI組FUNDC1去磷酸化增多(P<0.05)；與NI組相比，DI組FUNDC1去磷酸化增多(P<0.05)。與NS組相比，DS組、NI組、DI組LC3-Ⅱ增多(P<0.05)；與DS組相比，NI組、DI組LC3-Ⅱ增多(P<0.05)；與NI組相比，DI組LC3-Ⅱ減少(P<0.05)。詳見表1、圖1、圖2。

表1 各組大鼠心肌梗死面積、去磷酸化FUNDC1、LC3-Ⅱ的比較(±s)

與NS組比較，1)P<0.05；與DS組比較，2)P<0.05；與NI組比較，3)P< 0.05

圖1 各組大鼠心肌梗死面積TTC染色結果

圖2 各組大鼠心肌組織FUNDC1、LC3-Ⅱ western-blot檢測條帶

2.2 光鏡下觀察結果 NS組心肌細胞形態正常，胞質染色均勻，胞核居中，結構完整；DS組心肌纖維排列稍紊亂，胞漿有輕度的腫脹，可見少量炎細胞浸潤；NI組細胞形態不規則，心肌纖維排列紊亂或斷裂，胞漿有不同程度的腫脹甚至破裂，胞核排列不齊、碎裂和溶解；DI組心肌病理損傷程度較NI組增強，心肌纖維斷裂，心肌細胞崩解，細胞核溶解，染色加深，可見大量炎細胞浸潤。詳見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織病理切片HE染色(×400)

2.3 電鏡下觀察結果 NS組心肌纖維排列規整，線粒體結構清晰，形態較規整，嵴密集；DS組肌纖維排列較為整齊，部線粒體出現形態變化、分嵴數量減少或斷裂；NI組肌絲排列紊亂，線粒體結構破壞，嵴減少，并可見大量的自噬小體；DI組心肌細胞損傷明顯加重，肌絲溶解，隨處可見線粒體分裂，嵴斷裂溶解，自噬小體數量減少。詳見圖4。

圖4各組大鼠心肌組織透射電鏡切片觀察

3 討 論

本研究參照文獻[7]方法，禁食不禁水10 h后腹腔注射1%鏈脲佐菌素60 mg/kg建立大鼠糖尿病模型，給藥72 h后測量空腹血糖≥16.7 mmol/L，并出現多飲、多尿、多食和體重減輕，提示模型建立成功。同時參照文獻[8]的方法，結扎冠狀動脈左前降支，結扎后心電圖顯示ST段抬高，T波倒置，病理性Q波，肉眼觀察結扎區域心肌組織顏色蒼白，TTC染色發現心肌梗死面積增大，病理學與超微結構損傷加重，提示大鼠心肌梗死模型制備成功。

急性心肌梗死是引起糖尿病病人死亡的重要原因，糖尿病病人對心肌缺血性損傷的易感性增加。糖尿病病人體內存在糖和脂質代謝異常、氧化應激、糖基化產物堆積等眾多因素可以引起心肌結構和功能破壞，使得心肌在應對缺血缺氧時適應性代償反應減弱，損傷加重。近年來的研究表明，自噬在急性心肌梗死等缺血性心臟疾病中發揮了重要保護作用，能夠減少由心肌缺血引起的細胞死亡[9]；抑制自噬會導致心肌梗死后的缺血性損傷加重[10]。FUNDC1是缺氧誘發線粒體自噬所必需的一種新的線粒體相關膜蛋白[11]，普遍表達于哺乳動物體內，尤其是心臟。正常情況下酪氨酸激酶(SRC)可以通過促使FUNDC1磷酸化而不介導自噬發生。當心肌梗死發生時，梗死血管供血區缺血缺氧，SRC失活導致FUNDC1發生去磷酸化，去磷酸化FUNDC1對LC3-Ⅱ有更強的親和力，能通過特定的結構域募集LC3-Ⅱ并且發生相互作用而介導自噬[5]，對抗營養物質缺乏、應激狀態等不利因素產生的影響。本研究結果表明，與NS組比較，NI組自噬小體數目增加，去磷酸化的FUNDC1增多，LC3-Ⅱ表達增強(P<0.05)，提示FUNDC1參與了心肌細胞自噬以對抗梗死后心肌缺血性損傷。

糖尿病心肌細胞自噬的啟動和發展是一個復雜的過程。研究表明，胰島素可以作為信號通過激活PI3K-Akt/PKB-mTOR通路抑制自噬的發生[12]。但糖尿病病人存在胰島素分泌不足或抵抗，自噬可能被激活。糖尿病病人體內的高血糖、脂質代謝異常、氧化應激、鈣離子超載、各種炎癥介質、胰島素樣物質等因素也可以作用于自噬，發揮激活或者抑制自噬的作用[13]。本實驗結果顯示，與NS組相比，DS組自噬小體數目增加，LC3-Ⅱ表達升高(P<0.05)，證明在糖尿病病人心肌細胞自噬水平升高。糖尿病病人心肌細胞表現出這種自噬狀態是各種激活和抑制因素共同作用的凈效應。

FUNDC1是缺氧誘導自噬的關鍵蛋白。Zhang等[6]通過敲除小鼠的FUNDC1基因，發現心肌缺血時缺血區自噬受到抑制，心肌損傷加重。本研究顯示，與NI組相比，DI組大鼠病理學與超微結構損傷加重，梗死面積增大，自噬小體數目減少，去磷酸化的FUNDC1減少，同時LC3-Ⅱ表達下調(P<0.05)，提示糖尿病大鼠心肌梗死后心肌損傷加重可能與梗死區心肌細胞去磷酸化的FUNDC1減少，自噬水平降低有關。有研究提示，糖尿病大鼠體內過表達的BCL-x可能是心肌梗死時心肌細胞FUNDC1去磷酸化減少的原因[14-16]，但具體的機制尚不明確，有待更進一步研究。綜上所述，糖尿病大鼠心肌梗死后心肌損傷加重可能與糖尿病抑制了梗死區心肌細胞FUNDC1去磷酸化有關。