WNT/β-catenin信號通路與EMs侵襲及預后的相關性

張星光，馬建婷，傅云雀，傅家欣

(浙江省余姚市人民醫院婦產科，浙江余姚315400)

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMs)是指活性子宮內膜組織種植在子宮腔外所引起的一組癥候群，是一種激素依賴性婦科疾病，好發于育齡期婦女[1]，臨床多表現為進行性加重的盆腔粘連、疼痛、不孕等癥狀，并有類似惡性腫瘤種植、向周圍組織侵襲及復發的生物學行為，嚴重影響患病婦女的身心健康和生活質量[2]。EMs的發病率呈逐年上升趨勢，發病年齡越來越趨于年輕化[3]。EMs的發病機制目前尚未明確，多以Sampson經血逆流種植學說為主導理論[4]。近年來，Wnt/β-catenin信號通路與EMs疾病發生、發展的相關性已引起學者們的廣泛關注[5]。

本研究通過對比EMs患者異位子宮內膜和非EMs患者正常子宮內膜中β-catenin、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase 9，MMP-9)和微血管密度(mierovasuclardensvit，MVD)的表達情況，同時結合EMs患者手術前后的血清CA125水平，分析Wnt/β-catenin信號通路在EMs侵襲發生機制中的作用及與疾病復發的相關性，為EMs靶向治療提供理論基礎。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2012年7月至2014年12月期間在余姚市人民醫院婦產科住院并行手術治療的EMs患者的異位子宮內膜組織標本100例作為觀察組。按照美國生育協會EMs分期標準(r-AFS)[6]進行分期，其中Ⅰ期21例，患者年齡為25～47歲，平均(34.9±5.8)歲；Ⅱ期38例，患者年齡為23～49歲，平均(37.1±6.4)歲；Ⅲ期26例，患者年齡為24～48歲，平均(36.4±5.3)歲；Ⅳ期15例，患者年齡為26～50歲，平均(37.8±7.2)歲。另收集同期因其他婦科良性疾病入院治療患者的正常子宮內膜組織標本100例作為對照組，患者年齡為25～46歲，平均(37.2±6.1)歲。

所選患者均無其他內外科合并癥，且術前3個月內未進行過激素類藥物治療。所收集標本均經病理證實為EMs。兩組患者在年齡、婦科合并癥、疾病分期等一般資料上比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究已經醫院倫理委員會審查批準，標本提供者已簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1免疫組化法檢測β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD在組織標本中的表達強度

對標本進行常規石蠟包埋，行連續切片，厚約4～5μm；組織切片脫蠟、梯度酒精水化；以新配制3%H2O2浸泡20min去除內源性過氧化物酶活性；檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(pH=6)；滴加5% BSA液封閉15min；滴加1:80稀釋的β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD一抗，4℃孵育過夜。次日滴加山羊抗兔IgG二抗37℃孵育20min，每步間以PBS沖洗5min×3次，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，透明，封片。以PBS溶液代替一抗作為陰性對照，以已知高表達組織陽性切片作為陽性對照。顯微鏡下觀察免疫組化切片，以胞核或胞漿出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。以Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件對鏡下染色圖片進行分析，病灶區內隨機選取5個具有代表意義的高倍視野(×400倍)，取平均光密度值反映β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的陽性表達強度。

1.2.2檢測EMs患者手術前后血清CA125的水平

對100例EMs患者手術前后分別于清晨空腹抽取靜脈血3mL，室溫下靜置1h后3 000r/min離心，取上層血清，-80℃保存待用。采用羅氏Cobas-6000生化免疫分析儀，以化學發光法檢測血清中CA125的水平，以大于正常參考值35IU/mL為陽性。

1.2.3 EMs患者復發情況

于手術1年后對EMs患者進行隨訪，記錄其復發情況。

1.3統計學方法

2結果

2.1兩組免疫組化結果的比較

β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD在異位子宮內膜組織和正常子宮內膜組織的腺上皮細胞和間質細胞中均有表達，以腺上皮細胞表達為主，顯色為棕黃色或棕褐色，見圖1。

觀察組β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的平均光密度值均顯著高于對照組(t值分別為3.254、5.426、2.537、2.091，均P<0.05)，觀察組β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的表達情況與EMs分期均呈顯著正相關(r值分別為0.834、0.651、0.588、0.742，均P<0.05)，其表達強度均隨著EMs分期增高而增高，見表1。

表1 兩組β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的表達及血清CA125水平的比較結果

注：*與對照組相比P<0.05；#與術前相比P<0.05。

2.2 EMs患者異位子宮內膜β-catenin、VEGF、MMP-9、MVD的表達強度與血清CA125水平的相關性

EMs患者術后血清CA125水平顯著低于術前水平(t=8.375，P<0.05)，EMs患者手術前、后血清CA125水平均與EMs分期呈顯著正相關(r值分別為0.622、0.781，均P<0.05)，其水平均隨著EMs分期及β-catenin、VEGF、MMP-9、MVD的表達強度增高而增高，見圖1。

注：圖A1～A4分別代表觀察組的β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD；圖B1～B4分別代表對照組的β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD。

圖1典型免疫組化圖像

Fig.1 Typical images of immunohistochemical assay

2.3 EMs患者異位子宮內膜β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的表達強度與復發的相關性

手術1年后對EMs患者進行隨訪，100例EMs患者復發11例，其中Ⅱ期EMs患者復發2例，Ⅲ期復發4例、Ⅳ期復發5例，未見Ⅰ期復發患者，EMs患者復發例數隨著分期增高呈現增長趨勢，表明β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的表達強度與EMs復發情況呈現一定的正相關性，但由于復發例數較少，每期各指標的表達強度與復發例數的相關性檢驗差異均無統計學意義(均P>0.05)。

3討論

3.1 Wnt/β-catenin信號通路與EMs發病的相關性

Wnt/β-catenin信號通路在人類生物學的各個方面都發揮著重要作用。已有研究證明，Wnt/β-catenin信號通路激活與多種腫瘤的發生、發展均有聯系，其不僅可調控腫瘤細胞的生長、發育和分化，還可參與腫瘤的侵襲和轉移過程[7]。近年來，Wnt/β-catenin信號通路與EMs發病的相關性已引起學者們的廣泛關注，其可能在促進異位子宮內膜細胞黏附、侵襲和血管生成過程中起著關鍵作用[1]。β-catenin是Wnt信號通路的重要調節因子之一，該通路可參與調控細胞的生長與增殖[8]，異位子宮內膜細胞可能存在β-catenin的蓄積現象，當β-catenin高表達時，Wnt信號通路可激活為開放狀態，同時可促進其下游因子VEGF和MMP-9的表達，當β-catenin低表達時，Wnt信號通路呈閉合狀態，VEGF和MMP-9的表達均顯著下降[5，9]。本研究對比分析了EMs患者異位子宮內膜和非EMs患者正常子宮內膜中β-catenin的表達情況，結果顯示，β-catenin在異位子宮內膜組織和正常子宮內膜組織腺上皮細胞和間質細胞中均有表達，以腺上皮細胞表達為主。觀察組β-catenin的表達強度均顯著高于對照組(均P<0.05)，且表達情況與EMs分期呈顯著正相關(均P<0.05)。

3.2 VEGF、MMP-9和MVD與EMs發病的相關性

研究發現，EMs患者腹腔內以病灶為中心的放射狀血管增生是該病的特征性改變之一，異位子宮內膜中的毛細血管總表面積較正常子宮內膜顯著增加，可見，新血管生成現象在EMs的發生、發展中起著一定的作用[10]。VEGF是一種具有高度特異性的血管生成因子，其可直接作用于血管內皮細胞，通過促進血管內皮細胞的有絲分裂、增加血管通透性、促進血管舒張、改善細胞外基質等方式，促進血管內皮細胞的增殖、誘發新生血管形成[11-12]。眾多學者研究發現，VEGF及其受體蛋白在EMs患者在位和異位子宮內膜中的水平均明顯升高，表明VEGF可能參與了子宮內膜細胞異位種植過程中的血管形成過程[13-14]。MMP-9是MMPs家族中相對分子質量最大的明膠酶，其能降解細胞外基質(extracellular matrix，ECM)中Ⅳ型、Ⅴ型膠原和明膠等主要成分，并能促進血管內皮細胞生長，誘發新生血管生成，同時還可通過與整合素的相互活化而加強細胞間的黏附作用，進而可能在子宮內膜細胞的異位黏附、種植、生長過程中發揮一定作用[15]。此外，MVD是對血管最密集部位進行的微小血管計數，是新生血管生成定量描述的金標準。子宮內膜黏附時，須有新生血管的建立才能維持內膜的生存與發展，內膜組織中MVD越高說明新生毛細血管越豐富，異位子宮內膜本身及其周圍組織新的血供的建立和維持是EMs發生的基礎條件。

上述重要的細胞因子均可能參與了EMs的發生、發展和轉移過程。本研究對比分析EMs患者異位子宮內膜和非EMs患者正常子宮內膜中VEGF、MMP-9和MVD的表達情況，結果顯示VEGF、MMP-9和MVD在異位子宮內膜組織和正常子宮內膜組織腺上皮細胞和間質細胞中均有表達，以腺上皮細胞表達為主。觀察組VEGF、MMP-9和MVD的表達強度均顯著高于對照組(均P<0.05)，且各指標的表達情況與EMs分期均呈顯著正相關(均P<0.05)。

3.3血清CA125水平與EMs發病及復發的相關性

EMs是一個激素依賴性疾病，患者接受治療多以保守手術為主，即只切掉病灶，保留卵巢、子宮、子宮內膜等。由于患者激素依舊處于分泌比較旺盛的階段，因而較易引起疾病復發，即一段時間后再次出現臨床癥狀，其程度可達到治療前水平甚至加重，EMs保守術后年復發率可達10%，5年復發率可達20%～40%[16]。CA125是體腔上皮細胞分泌的一種高分子糖蛋白表面抗原，可作為卵巢癌的診斷標記物，近年來也開始用于EMs的診斷、治療和預后監測，可作為臨床上EMs的血清學輔助檢測指標[17]。黃蓉等[18]研究發現，CA125與EMs的發生、發展及預后有關，其水平隨著EMs分期增加而呈升高趨勢。

本研究結合EMs患者手術前后的血清CA125水平、EMs分期及術后復發情況，分析β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的蛋白表達強度與復發的相關性，結果顯示，EMs患者術后血清CA125水平顯著低于術前水平(P<0.05)，手術前、后血清CA125水平與EMs分期均呈顯著正相關(均P<0.05)；手術1年后100例EMs患者復發11例，EMs患者復發例數與EMs分期及β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的表達強度亦呈現一定的正相關性，但由于復發例數較少，相關性檢驗差異均無統計學意義(均P>0.05)。

綜上所述，β-catenin、VEGF、MMP-9和MVD的高表達與EMs發病相關，表明Wnt/β-catenin信號通路對EMs的遷移和侵襲過程有一定的影響，且影響越大，術后疾病的復發可能性越大。