三種移植策略在反復種植失敗患者凍融胚胎移植周期中的應用比較

金琪，駱麗華，黃玲莉，吳莉，王昊昱，童先宏，劉雨生

(中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)，合肥 230001)

在體外受精-胚胎移植中反復種植失敗(RIF)的發生率達10%～15%[1]。造成RIF的原因中1/3是胚胎質量，2/3是子宮內膜容受性不良[2]。基于此，從篩選優質胚胎、改善內膜容受性以及促進子宮內膜與胚胎間相互作用這三個方面入手，尋求與之對應的移植策略可能會給RIF患者帶來益處。囊胚移植可以挑選出更有發育潛能的胚胎，提高胚胎種植率及臨床妊娠率，因此廣泛應用于RIF[3]。越來越多的研究者將序貫移植和內膜機械性刺激應用于臨床，試圖從改善內膜容受性、促進胚胎發育及種植來提高RIF患者妊娠成功率。臨床研究發現，與傳統的移植方法相比，序貫移植和內膜機械刺激均可以明顯提高RIF患者成功率[4-5]。但是這三種方法的優劣及臨床如何決策，目前尚缺乏文獻評價。本研究將臨床上常用的三種移植策略應用于RIF患者凍融胚胎移植周期中，并對臨床結果進行比較，旨在為臨床選擇RIF的干預策略提供參考。

資料與方法

一、研究對象及分組

回顧分析2016年6月至2017年12月在我院實施凍融胚胎移植的228例(228個周期)RIF患者的妊娠結局。

1.納入標準：(1)RIF診斷標準：40歲以下女性在至少3個新鮮或冷凍周期中移植了4個以上優質胚胎后仍未實現臨床妊娠者視為RIF；(2)本次移植前宮腔鏡及陰道B超檢查宮腔及子宮內膜符合以下條件：子宮內膜厚度>7 mm、無明顯子宮內膜炎癥、宮腔內膜息肉或輕度宮腔粘連經過處理宮腔形態屬于正常；(3)FSH<10 U/L，BMI<30 kg/m2；(4)有冷凍的第3天卵裂期和/或第 5 天囊胚期的胚胎，本次移植胚胎中至少有1枚優質胚胎。

2.排除標準：(1)夫婦任何一方染色體異常；(2)合并內科疾病如糖尿病、甲狀腺功能異常及自身免疫系統疾病；(3)中、重度宮腔粘連及子宮畸形；(4)血液高凝狀態；(5)子宮腺肌病；(6)輸卵管積水未行輸卵管近端結扎或輸卵管切除；(7)男方重度少弱精子癥。

3.分組：將患者分為研究組和對照組，研究組按照移植方案不同分為三組：A組(序貫移植組)：移植1枚卵裂期胚胎+1枚囊胚(40例)；B組(內膜機械性刺激組)：根據胚胎移植時間及數量的不同分為兩個亞組，B1組：子宮內膜機械性刺激+1枚囊胚移植(52例)；B2組：內膜機械性刺激+2枚卵裂期胚胎移植(47例)；C組(囊胚移植組)：移植1枚囊胚(40例)。對照組為移植2枚卵裂期胚胎(49例)。

二、研究方法

1.移植方案：內膜機械刺激方案：移植當月月經第3～5天采用小號刮匙輕柔搔扒宮腔一周，內膜條件適宜時移植卵裂期胚胎或囊胚；序貫移植方案：不進行內膜機械刺激，僅在同一個周期先移植卵裂期胚胎1枚，兩天后再移植囊胚1枚；囊胚移植方案：移植1枚囊胚。

2.凍融胚胎移植(FET)的內膜準備：激素替代周期：月經第3天開始口服戊酸雌二醇(補佳樂，廣州先靈藥業)3 mg bid，10 d后B超監測子宮內膜厚度，酌情調整藥物劑量。當子宮內膜厚度>8 mm時加用黃體酮(黃體酮注射液，浙江仙琚)40 mg qd+地屈孕酮(達芙通，雅培，荷蘭)10 mg bid轉化內膜。黃體酮轉化內膜第4天行卵裂期凍胚移植，第6天行囊胚移植。促排卵周期：適用于激素替代周期子宮內膜生長不佳的患者。具體促排方案：月經第3天開始來曲唑(芙瑞，江蘇恒瑞醫藥)2.5～5 mg/d，或他莫昔芬(三苯氧胺，揚子江藥業)20 mg/d，5 d后B超監測內膜厚度及卵泡大小，酌情添加HMG 37.5～75 U/d。當卵泡直徑>16 mm，根據血LH、E2和P水平適時予 HCG 6 000～8 000 U誘導排卵，HCG誘導后第5天行解凍卵裂期胚胎移植，第7天行解凍囊胚移植。HCG誘導后第2天予以黃體酮(黃體酮注射液，浙江仙琚)40 mg qd+地屈孕酮(達芙通，雅培，荷蘭)10 mg bid轉化內膜。

3.胚胎質量評估標準

(1)卵裂期胚胎評分標準：根據胚胎卵裂球大小、形態、數目、胞質及碎片將胚胎分為4級，Ⅰ級：胚胎卵裂球等大，形態規則，胞質均勻清晰，碎片無或<10%；Ⅱ級：胚胎卵裂球大小不等，形態欠規則，碎片在10.0%～25.0%；Ⅲ級：胚胎卵裂球大小不均，碎片在25.1%～50.0%；Ⅳ級：胚胎卵裂球大小不均，碎片>50.0%。Ⅰ、Ⅱ級胚胎為優質胚胎。

(2)囊胚評分標準：根據Gardner[6]提出的評價方法對第5天囊胚期胚胎根據囊胚腔的大小和是否孵化，將囊胚的發育分為6個時期。1期：早期有腔室囊胚，囊胚腔小于胚胎總體積的1/2；2期：囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的1/2；3期：完全擴張囊胚，囊胚腔完全占據了胚胎的總體積；4期：擴張囊胚，囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變薄；5期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6期：孵出的囊胚，囊胚全部從透明帶中逸出。

(3)處于3至6期的囊胚，還需對其內細胞團和滋養層細胞進行質量分級。內細胞團分級：A級，細胞數目多，排列緊密；B級，細胞數目少，排列松散；C級，細胞數目很少。滋養層細胞分級：A級，上皮細胞層由較多的細胞組成，結構致密；B級，上皮細胞層由不多的細胞組成，結構松散；C級，上皮細胞層由稀疏的細胞組成。其中，評分在3BB以上為優質囊胚。

三、妊娠結局判斷及觀察指標

移植后14 d檢測血清β-HCG水平，β-HCG陽性者于移植后30 d行陰道B超檢查，見孕囊者判定為臨床妊娠。

觀察指標：臨床妊娠率=B超見孕囊例數/總例數×100%，種植率=孕囊總數/總移植胚胎數×100%，早期流產率=流產例數/見孕囊例數×100%，多胎率=多胎例數/見孕囊例數×100%，異位妊娠率=異位妊娠例數/見孕囊例數×100%。

四、統計學分析

結 果

一、患者一般資料比較

三組患者年齡、不孕年限、體重指數及基礎FSH均無統計學差異(P>0.05)(表1)。

二、臨床結局比較

A組臨床妊娠率、種植率顯著高于對照組(P均<0.05)；B1組種植率顯著高于對照組(P<0.05)。多胎率、早期流產率、異位妊娠率各組間無統計學差異(P>0.05)(表2)。

表1 各組基本資料

表2 各組臨床結局比較 [%(n)]

注：與對照組比較，*P<0.05

討 論

體外受精-胚胎移植的成功與胚胎發育潛能及子宮內膜容受性密切相關。子宮內膜容受性的建立，子宮內膜與胚胎之間相互作用并達到精確的同步化是胚胎成功植入的關鍵。子宮內膜容受性的建立主要受到雌、孕激素的調節。子宮內膜局部產生的多種促炎因子、抑炎因子及信號分子，如前列腺素、生長因子、細胞因子、趨化因子、整合素、白血病抑制因子、雌激素和孕激素受體等也參與調節雌、孕激素的功能，使子宮內膜達到良好的容受狀態，為胚胎的生存、植入、分化提供一個適宜的微環境。胚胎在植入時需要足夠的趨化因子和炎癥細胞因子在母胎界面調節胚胎的侵入能力，保證胚胎成功著床[7-8]。另一方面，早期胚胎源性生長因子、細胞因子及信號分子可能對改善子宮內膜容受性、促進胚泡著床并維持妊娠有重要的作用。

Eyheremendy等[9]發現早期胚胎可以誘使內膜進入“ 種植窗 ” 狀態，可能與胚胎能分泌一些生長因子有關，如IL-1、轉化生長因子、表皮生長因子、粒細胞巨噬細胞刺激因子等，在促進胚胎發育的同時誘導子宮內膜容受性增加。Melnick等[10]比較了子宮內膜與胚胎共培養和單獨培養的胚胎卵裂率和囊胚形成率，發現共培養組胚胎的生長情況和囊胚形成率明顯優于單獨培養組。Binder 等[11]發現，在體外子宮內膜與胚胎共培養可以改善子宮內膜容受性，有利于胚胎生長及著床。以上研究結論說明子宮內膜與胚胎之間的作用是互利的。體外受精與自然受孕不同之處在于胚胎要在體外培養3～5 d，子宮內膜缺乏胚源性因子的刺激，內膜容受性可能受到影響，特別是對某些本身內膜容受性不良的患者影響更大。子宮內膜容受性低下也會影響胚胎發育及胚胎與子宮內膜的同步化，從而降低胚胎成功植入的幾率。研究發現，有30%不孕癥患者存在子宮內膜種植窗改變，表現為種植窗提前、推后或縮短[12]。臨床上部分患者RIF的原因可能是整倍體囊胚與植入窗口未同步化[13]。

囊胚移植作為臨床上RIF患者移植策略之一已達成廣泛共識，其與卵裂期胚胎相比有較大優勢。國內外研究發現：囊胚移植的臨床妊娠率和胚胎種植率明顯高于卵裂期胚胎移植[3]，早期流產率有降低的趨勢[14]，單囊胚移植是降低多胎妊娠風險的有效方法[14]。本研究發現，與卵裂期胚胎相比，單囊胚移植組臨床妊娠率、種植率均有升高的趨勢，而多胎率、早期流產率有降低的趨勢，但差異均沒有統計學意義(P>0.05)。

對于具有形態學“正常”的內膜及胚胎的RIF患者除了胚胎因素外，更多的原因可能在于子宮內膜微環境的不良，因此從改善子宮內膜容受性方面尋找對策成為臨床治療反復種植失敗的重要突破點。臨床發現，內膜機械性刺激可改善RIF患者的妊娠結局[15-17]。子宮內膜機械刺激作用的機制有以下三方面：(1)子宮內膜損傷可以促進子宮內膜干細胞生長及子宮內膜螺旋動脈生成，增加子宮內膜血流，促進子宮內膜腺體的發育并使基質細胞水腫和蛻膜化從而增加胚胎植入的可能性[18-19]；(2)內膜機械性刺激引發內膜炎癥反應，可以提高子宮內膜局部促炎因子的表達[20]，而早期胚胎種植在著床部位需要促炎因子的作用，使胚胎易于粘附在子宮內膜上，并促進滋養層細胞對子宮內膜的侵入；(3)基因調控方面，有研究發現在RIF患者中子宮內膜miRNA表達異常，包括miR-145，miR-23b和miR-99a的過度表達以及3種miRNAs的低表達[21]。子宮內膜損傷可能調控子宮內膜基因的miRNA表達，從而利于胚胎植入[22]。子宮內膜機械刺激的主要優勢在于改善子宮內膜容受性，本研究中內膜機械刺激組的不足之處有：(1)選擇囊胚移植，由于胚胎移植過晚，子宮內膜缺乏早期胚胎產生的胚源性生長因子、細胞因子及信號分子的調節作用，對某些內膜容受性不良的患者可能是無益的；囊胚體外培養存在培養失敗導致無胚胎移植的風險。(2)選擇卵裂期胚胎移植，缺乏了通過囊胚移植來挑選胚胎的優勢。

近年來研究發現：在RIF患者新鮮移植周期中，序貫移植組臨床妊娠率明顯高于卵裂期胚胎移植組[4]；在RIF患者凍融胚胎移植周期中，序貫移植組的臨床妊娠率和胚胎種植率均高于單純囊胚移植組；在非RIF患者IVF/ICSI 新鮮周期中發現序貫移植組的胚胎種植率、臨床妊娠率及活產率均高于卵裂期胚胎移植組，而流產率低于卵裂期胚胎移植組[10]。序貫移植的優勢：(1)第一次移入宮腔的胚胎產生的胚源性因子有助于創造最佳的內膜容受性狀態，促進胚胎的發育及種植，這是內膜機械性刺激無法完全替代的；(2)囊胚移植的優勢是可以挑選更有發育潛能的胚胎，囊胚與子宮內膜同步性更好，有助于提高胚胎種植率。我們的臨床研究初步顯示，序貫移植組(A組)與內膜機械刺激組(B1、B2)相比，臨床妊娠率有升高的趨勢，但差異沒有統計學意義(P>0.05)；(3)序貫移植可以減少因囊胚培養失敗無胚胎移植的風險，增加患者周期妊娠機會。Yazbeck等[23]研究顯示，42%的患者在D5/D6未獲得高質量囊胚，僅在D2/D3行單卵裂期胚胎移植，妊娠率為25.3%。本研究中擬序貫移植的患者中有12例囊胚培養失敗，僅行單卵裂期凍融胚胎移植，其臨床妊娠率為16.67%(2/12)。序貫移植的不足之處：(1)本研究結果顯示，序貫移植組較其他各組相比，多胎率有升高的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。Machtinger等[4]研究顯示，序貫移植多胎率達到50%，與該研究移植胚胎數目過多有關(研究組移植1～2枚卵裂期胚胎+1～2枚囊胚)。我們的體會是實施序貫移植一定要嚴格控制移植胚胎的數目；對于子宮畸形或瘢痕子宮等特殊人群應慎重選擇序貫移植。(2)序貫移植也存在囊胚培養失敗的風險，應慎重選擇。

綜上所述，我們認為RIF患者再次移植需要采取更加積極的策略，需要綜合每一種方法的作用機制及患者的具體情況進行決策。總體來說：選擇序貫移植、內膜機械性刺激+囊胚移植及囊胚移植三種移植策略均有改善妊娠結局的趨勢，三者中序貫移植與傳統卵裂期胚胎移植相比，可顯著提高臨床妊娠率及種植率。另外，其可以降低因囊胚培養失敗無胚胎移植的風險，但同時可能增加多胎妊娠的風險。臨床應根據患者的具體情況及各種方法的利弊選擇個體化移植策略，如薄型內膜采用內膜機械性刺激可以改善患者的子宮內膜容受性從而有助于改善妊娠結局；對于RIF中的特殊人群(如子宮畸形或瘢痕子宮、低反應、宮腔粘連分離術后患者等)，由于序貫移植有可能增加多胎妊娠的風險，遂要慎重選擇，可以選擇有效性及安全性兩方面均有兼顧的內膜機械刺激法結合單囊胚移植方案。