miRNA與子宮內膜異位癥的最新研究進展

李雅潔，高穎

(華中科技大學附屬協和醫院，武漢 430022)

子宮內膜異位癥(簡稱內異癥)指具有活性的子宮內膜組織(腺體和間質)在子宮體以外的部位生長繁殖，以進行性加重的痛經、不孕等為臨床特點的婦科疾病[1]。該疾病為激素依賴性疾病，故多見于育齡期女性。子宮內膜異位癥雖為良性疾病，但在行為學上卻具有類似惡性腫瘤的特點，如細胞遠處轉移、粘附、侵襲、種植、新生血管形成等。關于異位子宮內膜的來源至今尚未完全闡明，目前主要的理論學說包括異位種植學說、體腔上皮化生學說、誘導學說、遺傳因素、免疫與炎癥因素、在位內膜決定論等，其具體發病機制仍在不斷的研究中[2]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為21～25 nt的非編碼單鏈RNA。廣泛存在于真核生物中，序列具有高度保守性，主要作用于靶基因mRNA 3′非編碼區(3′untranslated region，3′-UTR)使靶mRNA表達沉默，在轉錄后水平上參與基因的表達調控，調節細胞的增殖凋亡、免疫炎癥等活動，從而參與多種疾病的病理生理過程[3]。已有研究人員檢測到內異癥患者在位內膜、異位內膜或血清中miRNA的表達圖譜與正常人具有差異性，且多數學者證實多種基因產物如血管內皮生長因子(VEGF)、細胞粘附因子、缺氧誘導因子(HIF-1α)、前列腺素等參與子宮內膜異位癥的發病機制[4-5]，那么miRNA是否在轉錄后水平參與內異癥的發病機制呢？本文對miRNA在子宮內膜細胞的增殖、凋亡、粘附、遷移、血管活性以及免疫炎癥等過程中參與的角色進行總結。

1.子宮內膜細胞的增殖與凋亡

異位內膜種植學說或者在位內膜決定論均揭示了異位病灶處的子宮內膜具有異常的增殖和凋亡能力，異位內膜細胞的增殖/凋亡失平衡，內膜細胞得以在病灶處種植發芽并繼續繁殖[6]。

miR-155：惡性腫瘤、心血管疾病、多囊卵巢綜合征、子宮內膜異位癥等多種疾病的研究已經揭示miRNA在疾病的發生發展中發揮著不可忽視的作用，參與細胞增殖分化、侵襲種植、免疫炎癥等多種生物學過程[7-8]。在“在位內膜決定論”的指導下，研究在位內膜與異位內膜的特點中發現兩者細胞中miR-155的表達水平均高于正常對照組，認為miR-155作用其靶向位點，在轉錄后水平發揮調控細胞增殖及凋亡的作用，但靶向通路機制目前還不明朗。紀娜等[9]證實了miR-155在異位內膜中高度表達，可能通過對Bax、Bcl-2、MMP2 和MMP9 的調控，增強子宮內膜細胞增生、粘附、侵襲的潛能。高玲等[10]檢測在位內膜細胞的miRNA表達，發現miR-155過表達，證實在轉錄后水平直接靶向Mers1的3’-UTR區調控Meis1的表達，調節子宮內膜基質細胞的增殖，抑制其凋亡。

miR-135：Hox基因(homeotic genes)即同源基因或同源異型基因，是一類專門調控生物形體的基因[11]。HOXA 10 基因參與子宮內膜細胞的增殖、分化等生物學過程并在子宮內膜容受性建立的過程中起著不可忽視的調控作用。Petracco等[12]研究發現子宮內膜中表達miR-135a及miR-135b。miR-135a的表達呈周期性改變，在卵泡期表達增加，排卵期下降，黃體期再次上調。研究發現在位及異位內膜細胞中miR-135a表達水平較正常對照組高3倍。盡管內異癥患者miR-135b表達失去周期性改變，但其整體表達水平明顯升高。該研究提示高表達的miR-135導致子宮內膜中HOXA10表達受到抑制。王芳等[13]研究結果與上述一致，認為子宮內膜異位癥是一種表觀遺傳學疾病。高水平的miR-135a 可抑制 HOXA10基因的表達，導致子宮內膜的增殖和容受性都下調，提示內異癥子宮內膜增殖期存在缺陷和潛在的表觀遺傳機制。

其他miRNA：Yang等[14]檢測到內異癥患者的異位內膜中miR-33b低度表達，體外實驗證實miR-33b可能通過調節Caspase 3活動及VEGF、MMP9的表達，從而調節異位內膜細胞的增殖與凋亡。Liang等[15]建立內異癥小鼠動物模型，認為異位內膜中低表達的miR-200c通過調節MALAT1 過表達從而促進子宮內膜基質細胞的增殖與遷移。韓國學者Park等[16]從紅參里提取皂苷，隨后用皂苷提取物處理培養的異位內膜基質細胞，觀察到經過處理的基質細胞內的miR-21-5p表達受到抑制，同時凋亡潛能增加。Eggers等[17]觀察到在內異癥或惡性腫瘤中miR-200b的表達受到抑制，miR-200b可能通過作用ZEB1、ZEB2和KLF4調節子宮內膜增殖、凋亡和侵襲。目前miRNA與子宮內膜細胞凋亡與增殖的文獻相對較多，結論也多種多樣。參與調節子宮內膜細胞增殖凋亡的過程可能存在多種miRNA及靶位點，一種miRNA可能作用多個靶蛋白，同一種通路可能由多種miRNA參與調節，由此形成一個復雜的網絡通路參與調節子宮內膜細胞的生物過程。

2.子宮內膜細胞的新生血管形成

具有活性的子宮內膜組織在卵巢、腹膜等部位種植存活的一個必備條件是：新生血管的形成和建立。VEGF是新生血管形成的一個重要分子。已有研究報道，早期內異癥異位內膜或在位內膜中的VEGF表達水平均呈持續性顯著增高，且失去周期性改變，隨著病情的進一步發展，異位內膜中VEGF的表達水平呈下降趨勢[18-19]。這提示內異癥患者的在位內膜在分子水平層面已呈現新生血管活性異常的生物學特性。對于異位病灶，在疾病早期血管活性最強，晚期由于卵巢囊腫反復出血，存在壓迫并有壞死，導致異位病灶的血管形成活性減弱。

miR-199a：有研究報道miR-199a在肝癌、前列腺癌、子宮內膜癌、宮頸癌、食管癌等多種惡性腫瘤的發生發展過程中發揮著重要作用。miR-199在原發性肝細胞癌中的異常高表達，可通過靶向下調RGS17抑制肝癌細胞的增殖和遷移侵襲能力[20]。miR-199也參與子宮內膜異位癥的侵襲、遷移及血管生成過程。Hsu等[21]檢測了子宮內膜異位癥患者血清中miR-199a-5p的表達水平，發現其表達水平顯著降低，提出異位子宮內膜間質干細胞中腫瘤抑制基因(SMAD4)可能通過上調miR-199a-5p，作用于VEGF的3’端非編碼區，從而抑制異位子宮內膜間質干細胞的增殖、遷移及血管生成能力。為了進一步驗證miR-199a參與內異癥的發生發展，Dai等[22]檢測miR-199a在異位內膜及在位內膜組織中的表達水平，結果顯示兩者miR-199a表達水平均低于正常對照組，并且在異位子宮內膜中表達最低，提示異常表達的miR-199a通過阻礙IKKβ/NF KB通路及抑制IL-8的表達，削弱子宮內膜間質細胞的粘附、遷移、及侵襲能力。Dai等[23]后續研究發現當在位內膜遷延至卵巢、盆腹腔等處的缺氧環境中時低表達的miR-199可作用于HIF-1α/VEGF-A 通路，從而提高子宮內膜間質細胞的血管生成潛能。近年來，越來越多的學者開始研究miRNA與疾病的相互關系，但同時也發現該領域中存在的一些問題。例如：目前關于miRNA的檢測結果未能達到一致性，不同研究者檢測同一種類miRNA的結果可能相悖，不同研究者或選用不同研究方法檢測miRNA表達圖譜的不一致性等。這些可能與疾病的異質性、分期、miRNA穩定性、檢測方法等有關，相關困難還需要繼續努力克服。

3.免疫與炎癥

體腔上皮誘導學說中提出：某些炎癥或免疫因素可激活具有高度分化潛能的體腔上皮細胞，誘導內異癥的發生與發展。也有研究發現內異癥患者腹腔液中白細胞、巨噬細胞、趨化因子等增加，可能與亞臨床腹膜炎存在關聯[24]。因此有學者提出，內異癥本質是一種慢性非特異性免疫介導的炎癥性疾病[25]。

miR-141：在全身多種組織內均可以發現前列腺素，它是一類具有多種生理作用的活性物質。前列腺素可能參與內異癥的炎癥過程，同時誘導加劇患者的疼痛癥狀。環氧化酶(COX)是花生四烯酸轉化為前列腺素代謝過程中的關鍵酶，它存在兩種同工酶COX-1和COX-2[26]。張海燕等[27]的研究證實miR-141及COX在正常子宮內膜及在位內膜、異位內膜上均有表達，但內異癥患者miR-141呈低度表達，而COX-2呈高度表達，推測miR-141通過調節前列腺素代謝過程中的限速酶COX-2，改變盆腔組織中的炎癥相關內環境，從而誘導內異癥的形成。另外，Nematian等[28]也認為子宮內膜異位癥是一種異常的炎癥反應。他們抽取血液提取miRNA及炎癥指標，發現在內異癥患者外周血清中miR-125b-5p明顯升高，let-7b-5p明顯下降，TNF-α，IL-1β and IL-6呈高表達。也有報道miR-142-3p、miRNA-150調節IL-6、CX-CR4等炎癥介質，造成內異癥患者盆腔內高度炎癥改變。內異癥與炎癥學說目前仍處于初級探索階段，具體機制還不明朗。炎癥反應涉及多種細胞及活性因子，形成一個相互作用的復雜網絡，因此調節炎癥反應的miRNA可能存在多個靶點，從而調節多種活性因子的表達。

4.子宮內膜異位癥的惡性轉化

子宮內膜異位癥雖是良性疾病，但具有惡性腫瘤的特性，如侵襲、轉移、種植[29]。1925年，Sampson報道了內異癥與卵巢腫瘤密切相關且建立了第一個內異癥惡性轉化的組織學診斷標準，1953年Scott在此基礎上予以補充修訂[30]。盡管目前有文獻報道內異癥患者發生卵巢腫瘤(如透明細胞癌、子宮內膜樣腺癌)可能性增高，但完全滿足上述組織學診斷標準的病例較少[31]。內異癥與卵巢腫瘤間的因果關系仍需大量的研究以進一步探討。

miR-191：有學者應用分子病理學及流行病學的方法回顧分析了子宮內膜異位癥與子宮內膜異位癥相關卵巢癌之間的數據，探索內異癥的惡變潛能。在流行病學及組織病理學方面，發現卵巢癌(尤其是透明細胞癌、子宮內膜樣腺癌)伴內異癥的發病率高于其他婦科疾病。在分子生物學層面，實驗證實兩種疾病病灶組織中存在共同的基因改變，如TIM3、DAPK1、PTEN等的突變，提示這兩種疾病之間可能存在惡性轉化的遺傳圖譜[32]。miRNA作為轉錄后水平調控的分子之一，參與細胞周期、增殖、凋亡、粘附代謝等多種生物學過程。已有實驗證實在這兩種疾病的病灶組織中miR-191均過度表達，同時發現TIM3與miRNA-191水平呈負相關表達。隨后敲除miR-191后發現TIM3表達升高，并且細胞的增殖能力增強，提示miR-191通過作用于TIM3調控子宮內膜細胞的增殖與凋亡，同時此通路對內異癥向相關卵巢癌的惡性轉化過程中起著關鍵的作用[33]。Tian等[34]的研究也證實了miRNA-191在子宮內膜異位癥及子宮內膜異位癥相關性卵巢癌中高度表達。但他們研究的下游靶點為DAPK1，認為過表達的miR-191直接抑制DAPK1的表達從而促進TNF-α的表達誘導細胞凋亡，該通路的調控機制失平衡后導致惡變的發生。文獻報道的與內異癥惡性轉化相關的miRNA還有許多。Wu等[35]采用高通量測序方法檢測子宮內膜樣卵巢癌與內異癥標本表達的miRNA圖譜，探索miRNA是否可以作為診斷及鑒別此疾病的生物學指標。發現miR-1、miR-133a、miR-451在卵巢癌患者標本中的表達顯著低于內異癥患者，相反miR-141、miR-200a、miR-200c和miR-3613在卵巢癌中的表達顯著升高。后續仍需更深入的組織學、細胞學等實驗深入研究。

5.參與子宮內膜異位癥的miRNA

目前子宮內膜異位癥與miRNA的關系研究主要集中在血清miRNA作為內異癥無創診斷生物學標志物和miRNA參與內異癥疾病發展機制兩個方面。

內異癥的診斷包括繼發性痛經、不孕等癥狀及子宮直腸陷凹、子宮骶韌帶等處觸痛結節，同時聯合血清學標志物CA125進行初步診斷，腹腔鏡下病灶直視及病理檢查是內異癥診斷的金標準。鑒于金標準為有創性檢查，近年來關于內異癥術前無創診斷的研究愈演愈熱。收集內異癥患者術前血清，與非內異癥對照組的血清對比，發現大部內異癥患者血清中miRNA呈低表達趨勢，如miRNA-199a-5p、miR-17-5p、miR-20a、miR-22、let-7b-5p、miR-17、miR-31。經檢測MMP-9在內異癥患者血清中呈高表達，關聯分析顯示與miR-199a-5p呈負相關，且miRNA-199a-5p表達量與內異癥的r-AFS分期也呈負相關[36]。Dai等[37]在2011.年檢測內異癥血清中miR-199a的表達也呈顯著性低表達。但2017年Maged等[38]檢測內異癥患者血清及腹腔積液miR-199a卻呈顯著性高表達。這可能與患者的分期、種族以及miR-199a穩定性有關。血清中的miRNA可來自全身各個器官組織，其表達受到多種因素的干擾，與直接檢測異位內膜組織中miRNA表達相比準確性較差。研究發現miR-125b-5p、miR-451a、miR-122、miR-199a、miR-154-5p、miR-145在內異癥患者血清中呈高表達趨勢。miR-125b-5p、let-7b-5p可能通過激活促炎性因子，參與內異癥免疫炎癥機制[39](表1)。眾多研究者采用多種方法篩選出多種miRNAs，但至今尚未篩選出靈敏度、特異度、精確度均較高的標志物。

表1 內異癥患者血清中具有統計學差異的miRNA

為了排除血液中miRNA受到多重因素的干擾，研究者定位于異位子宮內膜組織。獲取內異癥患者異位內膜或在位內膜，并與非內異癥的對照組相比較，發現內異癥患者在位內膜或異位內膜中存在多種miRNA的異常表達。其中miR-23a、miR-23b、miR-195、miR-126、miR-542-3p在內異癥患者異位內膜及在位內膜中均顯著低表達。miR-195通過作用FKN蛋白，從而促進子宮內膜的凋亡，抑制其增殖。在內異癥患者異位內膜及在位內膜中檢測到miR-195顯著降低，削弱子宮內膜的凋亡，促進增殖，從而參與該疾病的發生發展[45]。上文中提到有學者檢測內異癥患者術前miR-451a呈高表達趨勢，隨后學者又檢測內異癥異位內膜及在位內膜中miR-451a的表達，均獲得一致的變化趨勢[41]。鑒于內異癥患者多為年輕女性，多采用腹腔鏡診斷并剝除異位病灶，很少同時行宮腔操作，故同時獲取同一患者異位內膜及在位內膜的組織標本存在一定難度。部分學者僅獲取異位內膜與非內異癥患者的子宮內膜進行對照分析，發現miR-556-3p、miR-33b、miR-199a-5p在異位內膜中表達均顯著下降。異位內膜中低表達的miR-33b可以調控Caspase-3的活性，增加VEGF、MMP-9表達，參與促進子宮內膜組織增生的過程[14]。miR-556-3p、miRNA-199a-5p可能也參與VEGF表達的調控，從而參與內異癥的發病過程[46](表2)。在深入研究內異癥發病機制這方面，還需要更多的努力。

表2 內異癥患者異位內膜或在位內膜中具有統計學差異的miRNA

miRNA的發現及其相關性研究為疾病病理生理機制提供了一個重大的思維突破。眾多miRNA及其靶基因構成了復雜的調控網絡，一種miRNA可以在轉錄后水平調控多個基因的表達，多種miRNA的組合也可以精細調控某個基因的表達協同發揮作用[51]。miRNA通過介導靶基因信號通路的轉導調節細胞增殖分化、凋亡、代謝等進程，參與異位內膜增殖凋亡、遷移、侵襲、種植，免疫炎癥等生物活動?，F研究已表明內異癥患者存在與正常女性明顯差異的miRNA，有多篇文獻對內異癥患者miRNA表達譜進行分析并篩選出特異性分子標志物。遺憾的是因內異癥的異質性以及miRNA的復雜性，目前還沒有穩定性較高、特異性強、準確度高的分子指標用于指導臨床診斷或治療。盡管內異癥與miRNA的相關性研究眾多，但是多數研究樣本量較少，且各研究所測出的差異性miRNA并不一致，甚至有些研究結果相悖。另外，關注點多集中于檢測差異性miRNA，功能分析相對較少。已有研究證明部分miRNA參與內異癥細胞的增殖凋亡、遷移、粘附、新生血管形成的過程，但其具體作用機制還不明朗，仍處于初級探索階段。在功能分析方面，多集中于子宮內膜細胞增殖凋亡及遷移、新生血管生成的作用機制探索，免疫炎癥機制相對稀少。miRNA在疾病發生發展過程中參與的角色，我們僅看到了冰山的一角，仍需繼續對miRNA的功能深入研究。