胚胎植入前遺傳學診斷的臨床應用分析

黃秋香，王志紅，劉蕓*，林春麗，陳智鏢，黃吳鍵，毛麗華，何凌云

(福建醫科大學福總臨床醫學院(第九○○醫院)/廈門大學附屬東方醫院(第九○○醫院)1.婦產科生殖中心；2. 實驗科，福州 350025)

胚胎植入前遺傳學診斷(PGD)技術是針對具有明確的致病基因或染色體異常攜帶者的夫婦進行促排卵，借助體外受精-胚胎移植技術對早期胚胎進行植入前活檢和遺傳學分析，將檢測正常的胚胎植入子宮，從而獲得健康胎兒的一種孕前診斷技術。Handyside等[1]首次成功應用PGD技術使一對有性連鎖隱性遺傳病的夫婦誕下健康女嬰。此后PGD技術發展迅猛，結合人類輔助生殖技術的發展，幫助有遺傳風險夫婦精準檢測其胚胎實現優生優育，有效控制了出生缺陷。PGD目前主要應用于染色體異常和單基因遺傳病兩大類疾病的檢測，雖然國內很多研究報道PGD能明顯改善臨床結局[2-4]，但大部分僅對某一遺傳疾病進行研究，尚缺乏全面臨床數據證實。因此本研究選取本中心136例PGD臨床病例，按照不同臨床適應證進行統計分析，為PGD技術的臨床應用提供參考。

材料與方法

一、研究對象

選取2013年11月至2017年12月在本院生殖中心行PGD治療的136對夫婦作為研究對象。所有夫婦均經過遺傳咨詢并簽署PGD知情同意書。本PGD項目經衛生行政部門審批并經醫院倫理委員會批準開展。

納入標準：(1)染色體結構異常：包括相互易位、羅氏易位、倒位、復雜易位、致病性微缺失或微重復等；(2)染色體數目異常：包括47，XYY綜合征、Turner綜合征、克氏征等；(3)有遺傳病家族史且已明確致病基因位點的常染色體顯性、常染色體隱性、性連鎖遺傳的單基因遺傳病夫婦。

二、方法

1. 胚胎體外受精、培養和活檢：采用本中心常規方案進行控制性促排卵。取卵后4～6 h用卵胞漿內單精子顯微注射受精，置于G1(Vitrolife，瑞典)微滴培養。取卵后D3觀察卵裂情況，將卵裂胚胎[受精日觀察原核(Pronucleus，PN)為2PN、0PN或1PN受精，不含多原核受精胚胎]轉入含有G2(Vitrolife，瑞典)微滴進行囊胚培養。至D5/D6/D7，對可行活檢胚胎參照文獻[5]操作，取5～10個滋養層細胞。活檢過的胚胎冷凍保存。

2. PGD步驟：PGD檢測采用NGS技術。2013年11月至2017年08月期間，染色體病患者的活檢細胞采用SurePlex法(SurePlex DNA Amplication Kit，Illumina，美國)進行全基因組擴增(WGA)，擴增產物使用Proton測序，檢測胚胎23對染色體，包括父源或母源異常染色體，篩除非整倍體及拷貝數變異(CNVs)4 Mbp以上缺失或重復的胚胎；2017年09月至12月期間，1例染色體缺失患者和14例平衡易位患者的活檢細胞采用多次退火環狀循環擴增技術(MALBAC)進行WGA，擴增產物使用Hiseq2500(Illumina，美國)測序，檢測范圍同上述，且平衡易位患者的整倍體胚胎采用等位基因映射識別胚胎平衡易位攜帶狀態技術(MaReCS)經單核苷酸多態性(SNP)連鎖分析區分正常胚胎和易位攜帶胚胎[6]。

單基因病PGD中1例馬凡綜合征患者的活檢細胞采用多重置換擴增(MDA)(REPLI-g Single Cell Kit，Qiagen，德國)進行WGA，擴增產物使用Proton測序，進行SNP連鎖分析和突變位點序列分析；其他單基因病利用高通量測序技術同時進行突變位點和染色體異常以及連鎖分析的新策略(MARSALA)[7]：患者的活檢細胞先采用MALBAC法進行WGA，然后針對患者突變位點附近的SNP對WGA產物進行特異性PCR，再將PCR產物與WGA產物混合，以低測序深度進行NGS。

3. 胚胎移植與隨訪：根據PGD結果，擇期選擇正常胚胎進行移植。移植后14 d檢測尿及血HCG，35 d后B超觀察到妊娠囊，可確認為臨床妊娠。妊娠18～23周行羊膜腔穿刺，抽取羊水進行產前診斷，并隨訪臨床結局。

三、統計學分析

數據統計以SPSS 19.0版軟件進行統計處理，組間比較用X2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、PGD周期的臨床資料

2013年11月至2017年12月共行PGD 136例，172個取卵周期，女方平均年齡(29.9±4.2)歲。136例中，染色體病116例，8個病種，占85.3%，其中2例嵌合體，核型分別為45，X[43]/46，XX，[57]和46，XX，t(11；22)(q23；q11.2)[70]/46，XX[30]；單基因病20例，8個病種，占14.7%(表1)。

表1 PGD周期臨床資料(-±s)

二、PGD結果

全部采用囊胚期活檢，136個PGD周期共成功活檢474個胚胎：21個擴增失敗(4.4%)，19個全基因組擴增后未行NGS檢測(有3例患者由于活檢胚胎數目較多，檢測費用較高，故選擇全部胚胎活檢、全基因組擴增，數個胚胎行NGS檢測)，明確診斷數434個，其中正常或攜帶者胚胎221個，異常胚胎213個，胚胎正常或攜帶者概率為50.9%。

染色體病PGD結果：共活檢403個胚胎，明確診斷數367個，正常或易位攜帶胚胎175個，其中易位組有30個胚胎經SNP連鎖分析區分出21個正常胚胎和9個易位攜帶胚胎。2例嵌合體患者的6個胚胎，染色體異常率達66.7%，可能是由于母源嵌合較高比例異常染色體所致。比較兩種全基因組擴增方法，即Sureplex法和MALBACA法，擴增失敗率無統計學意義(P>0.05)(表2)。

單基因病PGD結果：共活檢71個胚胎，明確診斷數67個，其中馬凡綜合征患者的3個胚胎僅進行突變位點序列分析+SNP連鎖分析，發現2個胚胎為正常基因胚胎。其余單基因病家系的64個胚胎進行MARSALA分析，發現有44個胚胎為正常基因型或表型正常的致病基因攜帶者且染色體正常(表3、4)。

表2 染色體病PGD結果 [n(%)]

注：與SurePlex擴增法比較，*P>0.05;#相互易位組24個胚胎被明確區分為正常和易位攜帶：17個為正常胚胎，7個為易位攜帶胚胎；羅氏易位組6個胚胎被明確區分為正常和易位攜帶：4個為正常胚胎，2個為易位攜帶胚胎

表3 隱性遺傳病PGD結果[n(%)]

注：Chr：染色體

表4 顯性遺傳病PGD結果 [n(%)]

注：Chr：染色體；*馬凡綜合征組中有3個活檢胚胎僅突變位點序列分析和SNP連鎖分析，不列入統計

三、PGD臨床妊娠結局

截止2018年9月30日，在136例PGD患者中，有12例患者無正常胚胎可移植，23例患者無囊胚形成，3例患者有正常胚胎但未解凍移植。

98例患者進行了115個周期的解凍移植，均為單囊胚移植，解凍后復蘇率100%，76例獲臨床妊娠，臨床妊娠率66.1%(76/115)，4例流產，流產率5.3%(4/76)，2例多胎妊娠，2例發生宮外孕，11例持續妊娠中，59例已成功分娩31個男嬰和30個女嬰，除1例單卵雙胎分娩的2個男嬰中有1個男嬰肺動脈高壓，肺泡發育欠佳，另1個男嬰巨結腸外，其余嬰兒均身體健康。

采用 MaReCS技術檢測的患者解凍移植選擇胚胎時，首選正常胚胎，其次易位攜帶胚胎。13例染色體易位PGD患者進行15個解凍移植周期，9例獲臨床妊娠，1例流產(表5)。

表5 PGD胚胎移植及臨床結局 [n(%)]

注：*相互易位組中10例患者移植的11個胚胎：10個正常胚胎(5個臨床妊娠)和1個易位攜帶胚胎(臨床妊娠，該患者僅1個正常胚胎，第一次移植未獲妊娠，此為第二次移植)；*羅氏易位組中3例患者移植的4個胚胎：3個正常胚胎(2個臨床妊娠，1個流產)和1個易位攜帶胚胎(臨床妊娠，該患者無正常胚胎可移植)

討 論

2015年歐洲人類生殖與胚胎學學會(ESHRE)報道了62個中心5 780個取卵周期的數據：2 979個胚胎植入前遺傳學篩查(PGS)周期，1 574個單基因疾病周期，1 071個染色體異常周期，108個X染色體連鎖疾病周期，48個社會性別選擇周期[8]。在本文統計中PGD患者以染色體異常居多，占85.3%(116/136)，染色體易位在其中占77.6%(90/116)，為最常見的染色體異常。克氏征、47，XYY和染色體倒位等病例在開展PGD治療初期列入PGD范圍，后根據胚胎檢測結果及文獻復習，我們認為這部分病例采用常規體外受精即可或者若有不良孕產史者可行PGS治療，故2017年后就將克氏征、47，XYY和染色體倒位剔出PGD適應證。PGD治療的單基因病有8個病種，地中海貧血最多，達65.0%(13/20)，可能與我中心地處地中海高發地域有關，同時也顯示出我們檢測單基因病的病種和周期數明顯少于文獻報道的數據，分析其原因可能為：(1)本中心開展PGD工作量并不大，所診療的患者中單基因病病種不夠多，需積累更多病例觀察；(2)單基因病的診斷技術仍需改善，待開拓更多的可診斷病種和方法。

鑒于對卵裂期活檢局限性的研究報道[9-11]，以及受益于胚胎序貫培養至囊胚階段的成功、胚胎玻璃化冷凍技術的開展，囊胚滋養外胚層細胞活檢受到廣泛運用，故本文全部采用囊胚期活檢，以獲得足夠數量的細胞保證足夠的擴增產物進行檢測，且保障了胚胎的安全。

本文采用具有高通量、低成本、耗時少等優點的NGS技術進行PGD。染色體疾病不再傳統地僅針對親代異常的染色體進行檢測，而是全面檢測23對染色體，目前更進步到利用MaReCS技術判斷胚胎的染色體易位攜帶狀態，成功地將30個胚胎區分為21個正常胚胎和9個易位攜帶胚胎，達到阻斷平衡易位向子代的傳遞。同時比較了兩種WGA方法的擴增失敗率，因為WGA是NGS關鍵一步，其擴增的均一性和保真度是精確測定拷貝數變異和單核苷酸變異的前提條件，結果表明Sureplex法和MALBAC法在擴增失敗率上無統計學差異(P>0.05)，可應用于胚胎整倍性的NGS-PGD檢測，與Li等[12]研究報道一致。單基因病從最初突變位點序列分析結合STR連鎖分析，發展到一套完整的MARSALA技術，即突變位點序列分析+SNP單體型分析+染色體非整倍體分析，將單基因病家系PGD治療時女方年齡因素可影響胚胎染色體異常風險[13]因素考慮進去，大大提升了PGD的準確性和全面性，為選擇健康胚胎移植提供了有力保障。可見，基于NGS技術的PGD可精準檢測出染色體異常和致病基因突變，對于獲取正常胚胎、阻斷遺傳病傳播、避免出生缺陷意義重大。

常規PGD治療后需要進行孕期產前診斷，單胚胎移植可以避免雙胎或多胎妊娠造成產前診斷困難等不足，而且單囊胚移植在降低多胎妊娠率的同時仍能保持較高的臨床妊娠率[14-15]。故本文PGD患者均選擇單囊胚解凍移植，其臨床結局亦證實這點，臨床妊娠率66.1%，

多胎妊娠率2.6%，PGD治療后所有孕中期產前診斷結果與PGD結果一致，共出生31個男嬰和30個女嬰，結果令人滿意。值得一提的是，采用 MaReCS技術檢測，13例染色體易位PGD患者解凍移植13個正常胚胎和2個易位攜帶胚胎，分別有7個和2個獲臨床妊娠。截止2018年9月30日，有4個正常胚胎和1個易位攜帶胚胎移植后孕中期羊水診斷核型分析確認結果與MaReCS結果一致，1個正常胚胎移植后流產，絨毛NGS檢測驗證確認結果亦與MaReCS結果一致。可見，MaReCS技術有望為染色體易位患者家庭改寫生育結局。