樺褐孔菌液體深層發酵菌株及配方優選研究

韓增華 楊洪博 戴肖東 馬銀鵬 陳賀 張丕奇*

（1黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010；2黑龍江省科學院高技術研究院，黑龍江哈爾濱150090；3東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）是十分珍貴的藥用真菌，由于其藥效顯著，近年來遭到過度采摘，面臨枯竭[1]。因其子實體與菌絲體內含有的成分和功效基本相當[2]，人們開始研究快速獲得菌絲體及其產物，來替代瀕臨枯竭的野生樺褐孔菌。深層發酵技術因其發酵周期短、產品質量穩定、產物收率高及占地面積小等優點，逐漸獲得認可[3-5]。20世紀末韓國開始使用深層發酵法生產樺褐孔菌多糖[6]，2004年我國開始相關研究[7-8]。樺褐孔菌液體發酵產菌絲及多糖量的變化受到諸如營養元素（氮源、碳源）和發酵條件等影響[9-12]，發酵培養獲得活性物質其活性高于或相當于從子實體中提取的物質活性[13-15]。試驗選用了5株樺褐孔菌菌株，通過單一碳、氮源比較，復合碳、氮源正交試驗，最終利用較廉價發酵原料，篩選出菌絲干重和胞內、外多糖收率高的適宜大生產的樺褐孔菌菌株及及發酵配方，為大規模液體發酵生產樺褐孔菌菌絲體及其多糖提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試樺褐孔菌菌株

試驗的5個樺褐孔菌菌株見表1，由黑龍江省科學院食用菌菌種保藏中心提供[16]。

表1 樺褐孔菌試驗菌株

1.1.2 試驗碳、氮源

碳源：葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、CMC（羧甲基纖維素）、糊精、纖維二糖、CMC-Na（羧甲基纖維鈉）。

氮源：蛋白胨、酵母粉、黃豆粉、尿素、硫酸銨、硝酸鈉、麩皮、酵母膏、KNO3、牛肉膏。

1.1.3 供試培養基

母種培養基cPDA：馬鈴薯200 g/L（煮汁1000 mL），瓊脂粉14.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨0.5 g/L，磷酸二氫鉀 3.0 g/L，硫酸鎂 1.5 g/L，VB110.0 mg/L，pH自然。

發酵種子液培養基、菌株比較培養基：葡萄糖20.0 g/L，酵母膏 4.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB110 mg/L，初始pH4.0。

碳源試驗培養基：碳源20.0 g/L，酵母膏4.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB110 mg/L，初始pH4.0。

葡萄糖復合碳源試驗培養基：碳源10.0 g/L，葡萄糖 10.0 g/L，酵母膏 4.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB110 mg/L，初始pH4.0。

氮源試驗培養基：氮源4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB110 mg/L，初始pH4.0。

酵母膏復合氮源試驗培養基：氮源2.0 g/L，酵母膏 2.0 g/L，葡萄糖 20.0 g/L；H2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，VB110 mg/L，初始pH4.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 樺褐孔菌菌種的復壯

實驗室保藏菌株用cPDA培養基轉接2次，每次25℃培養10 d。

1.2.2 種子液培養

按配方配制種子液培養基，250 mL三角瓶裝100 mL，110℃滅菌20 min，冷卻后接入復壯的母種。每瓶用滅菌的自制接種針接種2.0 mm×2.0 mm大小的菌絲體10塊，溫度27℃，轉速160 r/min，培養5 d，為發酵種子液。

1.2.3 菌球直徑及菌絲體干重測定

將種子液按10%（V∶V）接種量轉入各不同發酵培養基，溫度27℃，搖床轉速160 r/min，培養時間7 d，鏡檢無雜菌，布氏漏斗抽濾收集菌絲和發酵液，菌絲用ddH2O洗滌至濾液澄清，60℃干燥箱烘至恒重，稱重為菌絲體干重。將發酵菌液倒入培養皿中，隨機取20個菌球排成一行測量總長度，精確至1.0 mm，以菌球平均直徑計算菌球的大小，3次重復。平均直徑（mm）=菌球總長度（mm）/菌球個數（個）。

1.2.4 碳源、氮源篩選試驗

按配方制備碳源和復合碳源培養基，氮源和復合氮源培養基，250 mL三角瓶裝100 mL，接10%（V∶V）種子液，每個配方3次重復。搖床轉速160 r/min，溫度27℃培養7 d，鏡檢無雜菌后，布氏漏斗抽濾收集菌絲和發酵液。

觀察記錄菌球顏色、大小、菌球邊緣整齊度、均一度、菌絲干重，測定菌絲體多糖和發酵液多糖，并進行差異顯著性分析。

1.2.5 復合碳、氮源正交試驗

在前期試驗確定的搖瓶發酵培養最佳條件基礎上，選用葡萄糖、麥芽糖、豆粉、酵母膏四個因素，設計了L9（34）正交試驗（表2），以菌絲體干重為目標參數，結合胞內、外多糖含量，確定深層發酵的復合碳、氮源比例，篩選出高效發酵培養基配方。

1.2.6 多糖的提取測定

布氏漏斗抽濾發酵菌絲液，濾液部分80℃加熱濃縮至1/4體積，加入4倍體積95%的乙醇，攪拌均勻，4℃沉淀過夜，8000 r/min離心10 min，去上清液，沉淀用無水乙醇洗滌2次，離心得沉淀，冷凍干燥得發酵液粗多糖。菌絲體60℃干燥至恒重，小型中藥粉碎機粉碎，過120目篩，稱取1.000 g，離心管中按體積比1∶5加入菌粉、雙蒸餾水，冰浴超聲5 s間歇5 s超聲5 min，95℃水浴加熱2 h，冷卻后8000 r/min離心10 min，收集上清液，向離心管中加入雙蒸餾水，重復上述操作，合并兩次上清液，真空濃縮定容至20 mL。加入4倍體積95%乙醇，充分攪拌混勻，在溫度4℃沉淀過夜，8000 r/min離心10 min，去上清，沉淀用無水乙醇洗滌2次，離心得沉淀，冷凍干燥得菌絲體多糖。多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[17]。

表2 深層發酵碳、氮源正交優化L9（34）設計因素水平

2 結果與分析

2.1 供試樺褐孔菌菌株的液體培養性狀比較

5個供試樺褐孔菌菌株液體發酵結果見表3。由表3可見，供試菌株在菌球數量和菌球直徑上差異不顯著（P＜0.05），但在形態上有差別。In 4菌株菌球小而蓬松，數量多、生長快，大小均勻，發酵液顏色淡黃色，菌絲干重12.41 mg/mL，較In 1菌株高96%。其次是In 3菌株，除菌球直徑較大外，與In 4菌株差異較小，菌絲干重是In 4菌株的92.8%。In 1菌株表現不佳，菌球大小不均勻、不規則，發酵液顏色最深，菌絲干重最低，與其他菌株差異顯著（P＜0.05）。菌絲干重In 3菌株與In 4、In 5菌株差異不顯著，與其他菌株差異顯著（P＜0.05）。

In 4菌株發酵液多糖含量最高，達6.95 mg/mL，比In 1菌株高90%，In 1菌株發酵液多糖含量最低。In 2、In 3、In 5菌株發酵液多糖含量差異不顯著，其他菌株間差異顯著（P＜0.05）。菌絲體多糖含量最高的是In 3菌株，其次是In 4菌株，In 1菌株菌絲體多糖含量最低，僅是In 3菌株的62%，各菌株菌絲體多糖含量差異顯著（P＜0.05）。綜合發酵結果，In 4菌株優勢顯著，碳、氮源篩選用In 4菌株。

2.2 單一碳、氮源對菌絲干重的影響

液體培養結果見表4。由表4可見，纖維二糖為碳源菌絲體最多，其次是葡萄糖，果糖、麥芽糖再次之。CMC-Na為碳源菌絲少，菌絲干重僅為纖維二糖的21.3%。顯著性分析表明，纖維二糖、葡萄糖為碳源兩者菌絲干重差異不顯著，與其他碳源差異顯著（P＜0.05）。

表3 供試樺褐孔菌菌株液體培養性狀比較

表4 單一碳、氮源對菌絲干重的影響（菌株In 4）

表5 復合碳、氮源對菌絲體收率的影響（菌株In 4）

豆粉作為氮源菌絲體干重大，但發酵后培養基中含有一定量的豆粉殘渣，菌球收集清洗困難，大規模發酵不宜用豆粉。酵母膏為氮源效果也很好，KNO3為氮源無菌球生成，硝酸鈉和尿素為氮源菌絲產量低。顯著性分析表明：蛋白胨、牛肉膏菌絲體干重差異不顯著，其他氮源處理間差異顯著（P＜0.05）。考慮到纖維二糖成本高，豆粉殘渣處理問題，因此以葡萄糖和酵母膏為基礎碳、氮源與其他碳、氮源進行復合碳、氮源篩選。

2.3 復合碳、氮源對菌絲干重的影響

葡萄糖、麥芽糖培養基菌絲體最多，達16.35 mg/mL，其次是纖維二糖，這2個復合碳源配方菌絲干重均高于對應的單一碳源組。果糖、可溶淀粉、乳糖復合碳源的菌絲干重低于對應的單一碳源的菌絲干重，其他復合碳源處理組菌絲干重都高于對應的單一碳源組，CMC-Na復合碳源菌絲干重最低。

酵母膏、黃豆粉復合氮源菌絲干重高于單一酵母膏氮源組，且發酵后培養基中豆粉殘渣幾乎看不見，便于菌絲清洗。除蛋白胨復合氮源組菌絲干重略低于其對應的單一氮源組外，其他復合氮源菌絲干重均高于對應的單一氮源。

顯著性分析表明，果糖、CMC復合碳源組間菌絲干重差異不顯著，其他復合碳源處理差異顯著（P＜0.05）。牛肉膏、酵母粉復合氮源組菌絲干重差異不顯著，其他處理組菌絲產量差異顯著（P＜0.05）。試驗篩選的復合碳源為葡萄糖、麥芽糖，復合氮源為黃豆粉、酵母膏，確立了正交復合配方篩選4因素。

表6 復合碳、氮源L9（34）正交試驗結果（菌株In 4）

2.4 復合碳、氮源L9（34）正交試驗

L9（34）正交試驗結果見表6。由表6可見，3、7、8組菌球數量多，直徑小，顏色淡，菌球均勻。1組菌球直徑大，菌球大小不均，顏色深。5組菌球數也較少。菌絲干重第9組最高，達22.04 mg/mL，發酵液多糖最高達11.3 mg/mL。其次是第8組，菌絲收率20.66 mg/mL，菌絲體多糖含量最高達136.9 mg/g，1組發酵產物收率最低，菌絲干重、菌絲體多糖和發酵液多糖分別是9組的31%、30%和38%。差異顯著性分析表明：第9組除與8組菌絲多糖差異不顯著外，在菌絲干重和發酵液多糖含量上較其他組差異顯著，其他各組間差異顯著（P＜0.05）。正交組合分析：4因素中以A因素（麥芽糖）級差最大，其對發酵菌絲體產量的影響最大，C因素（酵母膏）的影響最小。最優條件是：A3B3D1C2，即1.5%麥芽糖，1.5%葡萄糖，0.2%酵母膏及0.06%的豆粉效果最佳。

3 小結與討論

樺褐孔菌野生資源短缺，解決這一問題已經迫在眉睫，除了加大人工栽培技術研究力度外，液體發酵技術生產樺褐孔菌菌絲體是解決樺褐孔菌原材料不足的重要途徑[18]。

黃玲對2個樺褐孔菌菌株的發酵比較發現，兩菌株的菌絲體及粗多糖產量差異極顯著[19]，這一結果與本研究相符合。供試5個菌株間無論是發酵培養菌絲體性狀，還是發酵產物產量上差異明顯。In 4菌株發酵性狀表現優良，菌絲產量最高，菌絲干重與除In 3菌株外其他菌株差異顯著，而發酵液多糖和菌絲體多糖均高于供試其他菌株且差異顯著（P＜0.05）。

樺褐孔菌能利用的碳源較多，單糖、雙糖、大分子化合物均可，而氮源中有機氮源遠遠優于無機氮源，可能是有機氮中含有豐富的蛋白質、多肽、游離的氨基酸以及少量的脂肪、微量元素和生長素等，有利于菌絲體的生長和各種代謝產物的合成[20]。研究開展單一成分和復合碳、氮源篩選，目的是考察不同營養及多重營養因素下，盡可能地獲得最多發酵產物。不同的碳、氮源，菌絲體的生長及各種代謝產物的合成量有影響，無論是以培養樺褐孔菌菌絲體還是以多糖產量為目的，都可以篩選出廉價易得的培養原料。研究中纖維二糖為單一碳源菌絲干重雖高，但是成本較高，不適用于大生產。豆粉雖然廉價但殘渣處理困難，作為有機氮，可減少用量來滿足高效發酵之需。研究在單一碳、氮源篩選基礎上，完成兩組碳、氮源復合配方正交試驗，獲得一個高產配方：麥芽糖15.0 g/L，葡萄糖15.0 g/L，豆粉 0.6 g/L，酵母膏 2.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO41.5 g/L，VB110 mg/L，起始pH4.0。該配方發酵周期7 d，獲得菌絲干重22.0 mg/L，發酵液多糖11.3 mg/L，菌絲體多糖132.2 mg/L，試驗結果為大規模生產應用提供理論依據。