內蒙古五個環柄菇形態學及rDNA-ITS鑒定

田慧敏 張亞男 李曉東 呂曉娜

（赤峰學院生命科學學院，內蒙古赤峰024000）

環柄菇屬（Lepiota）隸屬擔子菌門（Basidiomycotina），層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaricales），傘菌科（Agaricaceae）。該屬的主要特征是所有種都腐生于地上，菌蓋小或中等，菌蓋具鱗片，菌柄著生菌環，菌褶色淺，白色或乳白色，離生或彎生，孢子橢圓形，卵圓形，無色、光滑，類糊精質，褶側囊體無，褶緣囊體豐富，棒狀或倒梨形[1-2]。據真菌索引統計，該屬真菌大約1500多種（包括變種和原變種）。近些年來，微觀形態及分子生物學技術在分類學上的廣泛應用，該類真菌的分類發生了很大變化，許多種如囊皮菌屬Cystoderma和粘傘屬Limacella一些種從其相應的屬分離出來獨立成屬[3-4]，同時白鬼傘屬Leucocoprinus、大環柄菇屬Macrolepiota、白環菇屬Leucoagaricus、Cystolepiota和 Echinoderma從環柄菇屬分離獨立成屬[5-6]。這些屬因其外形特征相似，同環柄菇屬（Lepiota）合稱環柄菇類“Lepiotoid”[7]。筆者采用形態學和ITS片段測序技術相結合的鑒定方法對赤峰市不同地區的四個有毒環柄菇類真菌進行鑒定，力求為環柄菇類快速識別提供依據，為其開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試標本來源

供試標本CFSZ11339、CFSZ11379由田慧敏等于2015-2017年采集于內蒙古赤峰市翁牛特旗，CFSZ10575采集于赤峰市新城區，CFSZ11356采集于赤峰市紅山區動物園。采集的標本在拍攝生境照片、觀察形態、測量數據、自然干燥、編寫號碼、超低溫冷凍等系列處理之后存放于赤峰學院生命科學院菌物本標室（CFSZ）。

1.2 形態鑒定

采用傳統鑒定方法，宏觀特征采用肉眼觀察、游標卡尺測量等方法，測量供試樣本的新鮮子實體大小、菌柄長度以及直徑、菌蓋直徑，觀察顏色。查閱文獻進行檢索、比對、定種；顯微結構在光學顯微鏡（奧特BED203）下觀察和測量孢子、擔子、菌蓋表皮、菌柄表皮菌絲形態及大小，所有數據均測量20個，用顯微照相系統（Olympus BX53）拍攝顯微結構相片，孢子測量Q1（長寬比范圍）和Q2（長寬比平均值），Q2=Qa±Qsd（標準誤）。

1.3 ITS鑒定

1.3.1 DNA的提取

取干子實體菌蓋的一小部分研磨，稱量30 mg，用基因組DNA提取試劑盒完成對基因組DNA的提取。

1.3.2 PCR擴增、純化及測序

PCR擴增反應在PCR擴增儀（eppendorf 5331）上進行。

經引物ITS1/ITS4進行50μL體系經PCR擴增后，在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。樣品PCR擴增之后的產物用Takara膠純化試劑盒純化后，交由上海生工生物工程技術服務有限公司完成測序。

圖1 肉褐鱗環柄菇子實體形態及微觀結構

1.3.3 ITS序列比對分析

將得到的ITS序列，通過Chromas軟件拼接，在GenBank數據庫中進行ITS序列的Blast比對，從檢索的結果里挑選出同源性比較高的ITS序列，利用MEGA5.1軟件構建系統發育樹，發育樹的每個分支的統計學顯著性分析以最大似然法進行檢驗，重復次數為1000次。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定結果

經形態學鑒定，CFSZ11379為肉褐鱗環柄菇Lepiota brunneoincarnata Chodat&C.Martín，CFSZ11356為冠狀環柄菇 Lepiota cristata（Bolton）P.Kumm.，CFSZ10575為紅蓋白環菇Leucoagaricus rubrotinctus（Peck）Singer，CFSZ11339 為粉褶白環菇Leucoagaricus leucothites（Vittadini）P.D.Orton。

2.1.1 肉褐鱗環柄菇LepiotabrunneoincarnataChodat&C.Martín

子實體小，菌蓋直徑1.6～2.4 cm，鐘形，開傘后平展，白色，密被褐色或黑褐色鱗片，中部鱗片較密色深呈黑褐色，邊緣有短條紋。菌褶白色，厚，較寬，有短菌褶，離生。菌肉污白色或肉色。菌柄長2.4～5.2 cm，直徑0.3～0.6 cm，圓柱形，基部稍膨大，淺肉色至肉粉色，菌環位于菌柄中下部，白色或淺肉色，往往邊緣變褐或變黑，菌環以下具有黑褐色顆粒狀附屬物（圖1A、B）。

擔孢子（6.5～8.4）μm×（4.3～5.8）μm，[Q1=1.29～1.70，Q2=1.59±0.16]，卵圓形，有油滴，無色，光滑，非淀粉質，類糊精質，在KOH溶液中變為銹紅色（圖1C、D）；擔子（20～30）μm×（6～7）μm，無色，棒狀，黃色顆粒狀物，具四個小梗，基部未見鎖狀聯合（圖1E）；褶緣囊體（24～36）μm×（7.2～12）μm，棒狀（圖1F），菌蓋表皮由無色菌絲組成，菌絲直徑7.0～12μm，無色，膨大，絲狀，分枝少（圖1G），蓋表鱗片由近似柵欄狀排列的菌絲組成，菌絲生長常倒伏，分枝，有隔膜，無色，具棕褐色色素，末端細胞（72～247.2）μm×（9.6～14.4）μm，紡錘形，長棒狀，圓柱形，頂端稍細，鎖狀聯合缺。

該種典型特點是菌蓋密被褐色鱗片，菌柄肉褐色，菌環以下密被黑褐色顆粒狀附屬物[8]。菌蓋表皮有膨大的菌絲，菌蓋鱗片由柵欄狀排列的菌絲組成，菌絲具棕褐色色素，菌絲頂端稍尖，屬于卵孢環柄菇組sec.Ovisporae[9]。該種在我國分布廣泛，富含鵝膏毒肽、鬼筆毒肽、鵝膏肽類毒素，可致肝腎損害、呼吸循環衰竭，誤食后發病危害肝腎，煩躁、抽搐、昏迷，死亡率高[10-11]。

研究標本為CFSZ11379，2016年7月31日由田慧敏、柳艷斌采自于內蒙古赤峰市，翁牛特旗五分地鎮巴林橋北，西拉沐淪河北岸道邊草地上。

2.1.2 冠狀環柄菇Lepiota cristata（Bolton）P.Kumm.

子實體小，菌蓋1.4～2.5 cm，近鐘形，后平展，乳白色，中央凸起，具淺棕色、紅棕色或黃褐色纖毛狀鱗片，中央密，向蓋緣鱗片逐漸稀疏，邊緣有短條紋；菌蓋遇KOH漸變黃色，菌褶白色，薄，直生或稍延生；菌肉白色，具淀粉香味；菌柄長1.4～4.2 cm，直徑0.1～0.2 cm，圓柱形，白色至淺灰色，中空，基部膨大呈球形，菌環上位，白色，膜質（圖2A、B）。

圖2 冠狀環柄菇子實體形態及微觀結構

孢子（6.7～9.1）μm×（4.3～6.2）μm，[Q1=（1.2～2.6，Q2=1.68±0.37]，楔形或瓜籽形，光滑，無色，非淀粉質，類糊精質（圖 2C、D）；擔子（19.2～31）μm×（6.0～7.2）μm，棒狀，無色，四個小梗，很短，基部具鎖狀聯合；褶側囊體缺失，褶緣囊體（19.2～39.0）μm×（8.4～12.0）μm，倒梨形或棒狀，無色（圖2E）。菌蓋表皮由膠化菌絲和無色菌絲組成，無色菌絲直徑7.2～12μm，分枝，頂端稍膨大，鈍圓，具鎖狀聯合；膠化菌絲直徑3.6～5μm，黃棕色，少，分枝；菌柄表皮菌絲排列整齊，直徑7.2～10.0μm，無色，（圖2F、G）。蓋表鱗片由長橢圓形、棒狀的菌絲細胞首尾相接組成，菌絲直徑9～12.0μm，無色，具隔膜，分枝少，末端細胞鈍圓（圖2H），菌柄表皮由排列整齊的菌絲組成，菌絲直徑7～9μm，無色，隔膜均勻，分枝少，排列整齊（圖2I）。

該種主要特征為子實體很小，菌蓋具紅棕色或黃鱗片，遇KOH變黃，菌柄光滑，具有楔形孢子，輕微的類糊精質，菌蓋表皮菌絲不成柵欄狀，無色，稍膨大，屬于環柄菇組 sec.Lepiota[9，12-14]，該種在我國分布廣泛，具腸胃性毒素，含有高濃度重金屬[10，15]。

研究標本為CFSZ11356，2016年7月31日由田慧敏、柳艷斌采自于內蒙古赤峰市新城區機場路西側葡萄采摘園地上。

2.1.3 紅蓋白環菇Leucoagaricus rubrotinctus（Peck）Singer（內蒙古新記錄種）

子實體中等大，菌蓋直徑2～4 cm，初期球形后平展，中央凸起，白色，具暗紅褐色纖毛狀鱗片，呈輻射狀，后期邊緣破裂或不破裂呈縱向纖毛狀。蓋面遇KOH漸變灰綠色，菌肉薄，白色，表皮下帶紅色。菌褶離生，稍密，不等長，白色。菌柄長約2.5 cm，粗0.2～0.3 cm，圓柱形，基部稍膨大，菌環以上淺米白色，菌環以下淺黃褐色，光滑，內部空心，干后變深。菌環膜質，白色，生菌柄的上部（圖3A）。

擔孢子（6.5～～9.6）μm×（3.0～5.3）μm，[Q1=（1.5～2.12），Q2=1.98±0.31]近卵圓形、長橢圓形，無色，光滑，類糊精質，在Melzer中變紅（圖3B、C）。擔子（19.0～33.6）μm×（5.3～9.4）μm，棒狀，無色，四個小梗（圖3D）；褶側囊狀體缺失，褶緣囊體（30～36）μm×（9～12）μm，棒狀或倒梨形（圖3E）。菌蓋表皮由兩種菌絲組成，一種是膠化菌絲，直徑5～9μm，金黃色，表面光滑，隔膜很少，不分枝，另一種菌絲直徑7.7～16.8μm，無色，具顆粒狀物，頂端鈍圓，稍膨大（圖3F）；蓋表鱗片由柵欄狀排列菌絲組成 ，有 隔 膜 ，末 端 細 胞（67～156）μm ×（14.4～26.4）μm，頂端鈍圓，基部狹細，無色，有的具淺棕色色素（圖3G），菌柄由排列整齊的無色菌絲組成，有的菌絲頂端稍膨大，直徑10.1～14.4μm。

該種主要特點是菌蓋密被酒紅色、紅褐色或橘紅色纖毛狀附屬物，中央色深呈乳頭狀，邊緣色淺，受傷不變色[16]。該種于1882由Peck描述命名Lepiota rubrotincta Peck[17]，1948年Singer將其歸入白環菇屬（Leucoagaricus），紅色組 sec.Rubrotincti[17]，該種為內蒙古新記錄種。

研究標本為CFSZ10575，2015年9月6日由田慧敏、柳艷斌等采自于內蒙古赤峰市紅山區動物園道邊雜草上。

圖3 紅蓋白環菇子實體形態及微觀結構

圖4 粉褶白環菇子實體形態及微觀結構

2.1.4 粉褶白環菇Leucoagaricus leucothites（Vittad.）Wasser=Lepiota leucothites（Vittadini）P.D.Orton

子實體小，菌蓋直徑2.2～3.6 cm，初鐘形或半球形，后平展，白色，中央有淺黃棕色平伏鱗片，干后邊緣有條紋，規則開裂。菌肉薄，白色，菌褶直生或彎生，稍密，不等長，白色，干后米黃色。菌柄長2～3 cm，粗0.2～0.3 cm，圓柱形，基部膨大，光滑，淺棕色，內部空心，老后變深至灰棕色。菌環膜質，白色，位于菌柄的上部（圖4A）。

圖5 球孢青褶傘子實體形態及微觀結構

擔孢子（6.5～10）μm×（3.6～4.8）μm，[Q1=（1.47～2.2），Q2=1.72±022]，長橢圓形，瓜子形，無色，光滑，類糊精質（圖 4B）。擔子（19.0～27.6）μm×（5.3～8.4）μm，棒狀，無色，四個小梗（圖4D），褶側囊狀體缺失，褶緣囊體（14.4～26.4）μm×（7.2～9.6）μm，倒梨形，無色（圖4E）。菌蓋表皮由無色菌絲組成，具無色顆粒狀物，（28.8～40.8）μm×（9.6～13.2）μm（圖4F）。菌蓋鱗片由無色菌絲首尾相接組成，菌絲直徑（9.6～18）μm，長橢圓形（圖4C）。菌柄表皮由排列整齊的菌絲組成，菌絲直徑7～10μm，隔膜均勻，淺棕色（圖4G）。

該種主要特點是子實體純白色，菌環白色，表面幼時光滑，有時菌蓋中央具淺黃棕色或米黃色鱗片，且菌蓋中央幼時會龜裂[18-19]。該種幼時與致命毒性的白毒傘Amanita verna相似，但是該種沒有菌托，注意區別，在我國分布廣泛，具胃腸道反應毒素，疑似有毒，慎食[20-21]。

研究標本為CFSZ11339，2016年7月30日由田慧敏、柳艷斌采自內蒙古赤峰市境內西拉沐淪河北岸巴林橋北草地。

2.1.5 球孢青褶傘Chlorophyllum sphaerosporum Z.W.Ge&Zhu L.Yang（內蒙古特有種）

子實體小到中等。菌蓋直徑2.3～5.2 cm，半球形，中間凸出，表面白色至污白色，附棕色至紅棕色的叢毛狀小鱗片，老后易脫落，邊緣有微弱的短條紋。干燥時，菌褶密，白色至奶油色，離生，不等長。菌柄長3～5 cm，粗0.3～0.8 cm，圓柱形基部上膨大，白色，受傷不變色，菌環位于菌柄上部，膜質，白色，可移動，易脫落（圖5A、B）。菌肉白色，薄，味溫和。

擔 孢 子（7.5～10.4）μm ×（7.0～9.6）μm，（Q1=1.02～1.25），Q2=1.18±0.05）近球形，寬橢圓形，光滑，透明，厚壁（約0.5μm），有小短柄，易脫落，糊精質（圖5D）；擔子（29～41）μm×（9.5～12.5）μm，棒狀，薄壁，4個孢子，透明，有的基部鎖狀聯合。褶側囊體無，褶緣囊體（24～36）μm×（8～10）μm，棒狀或寬棒狀，無色透明，薄壁。菌蓋表皮由特化的柵欄狀排列的菌絲組成，菌絲末端細胞（74～120）μm×（14.4～24.0）μm，形狀各異，棒狀、瓶形、腹鼓狀，無色。蓋表鱗片由柵欄形排列的菌絲組成，菌絲無色，具隔膜，分枝，末端細胞（21.6～31.2）μm×（6～10.1）μm，短棒狀或倒梨形。

球孢青褶傘外形與庭院青褶傘Ch.hortense相似，都具有白色菌蓋和棕色鱗片，孢子沒有芽孔，但是后者擔子著生2孢子，孢子橢圓形，菌柄受傷變色。而球孢青褶傘具有球形的孢子，孢子較小，在蓋表皮鱗片菌絲末端細胞呈短棒狀，頂端稍膨大[22]。分子檢索與Ch.lusitanicum相似度較高97%，但是二者形態差異很大，Ch.Lusitanicum子實體呈亞球形，孢子有臍狀附屬物[23]，該種首次發現于內蒙古[22]，但未見詳細描述，后期也沒有相關報道，為內蒙古特有種，食毒不明，甚食。

研究標本為CFSZ10555，2015年9月6日由田慧敏、柳艷斌等采自于內蒙古赤峰市紅山區動物園道邊雜草上。

2.2 rDNA-ITS測序鑒定結果

2.2.1 四個環柄菇樣品的ITS測序結果

四個樣品DNA的ITS序列，經檢測CFSZ11379長度為704 bp（登錄號為MG367257），CFSZ11356為710 bp（登錄號為MG367255），CFSZ 10575為698 bp（登錄號為MG367253），CFSZ11339為725 bp（登錄號為MG367254），CFSZ10555為720 bp。

2.2.2 五個環柄菇樣品ITS序列對比結果

將測得的五個標本ITS序列在GenBank數據庫進行Blast比對分析，每個標本選擇具有較高相似度的序列，共獲得30個真菌DNA序列（表1）。

表1 與供試環柄菇5個標本rDNA-ITS序列最相似的物種

2.2.3 系統發育樹分析結果

對五個樣本CFSZ11339、CFSZ11356、CFSZ11379、CFSZ10575、CFSZ10555的ITS序列及與其高度相似的序列構建系統發育樹。結果表明：所有序列一共三大分支，第一支白環菇屬（Leucoagaricus），第二支青褶傘屬（Chlorophyllum），第三支環柄菇屬Lepiota。其中CFSZ 11379與Lepiota brunneoincarnata聚在一起，結合宏觀特征和微觀結構將標本CFSZ11379鑒定為肉褐鱗環柄菇L.brunneoincarnata Chodat&C.Martín，CFSZ11356與 L.cristata聚在一起，結合宏觀特征和微觀結構將標本CFSZ11356鑒定為冠狀環柄菇Lepiota cristata（Bolton）P.Kumm.，CFSZ10575與La.rubrotinctus（Peck）Singer聚在一起，結合宏觀特征和微觀結構將標本CFSZ10575鑒定為紅蓋白環菇La.rubrotinctus（Peck）Singer，11339 與 La.leucothites聚在一起，結合宏觀特征和微觀結構將標本CFSZ 11339 鑒 定為 粉 褶 白 環菇 La.leucothites（Vittad.）Wasser，CFSZ10555 與 Chlorophyllum sphaerosporum聚在一起，結合宏觀特征和微觀結構將標本CFSZ10575鑒定為球孢青褶傘Chlorophyllum sphaerosporum Z.W.Ge&Zhu L.Yang。

3 小 結

圖6 系統發育樹

環柄菇類真菌分類復雜，種類多，很多種外形特征極其相似，很多種都有毒，有的種為劇毒，如褐鱗環柄菇（L.helveola Bres.）、酒紅環柄菇（L.josserandii Bon&Boiffard）等，誤食常會危及生命[10-11，22]。而且該類真菌往往分布在公園、農田、林緣、道邊、草地等地，被采食的概率極高，存在潛在的危險。詳細介紹了內蒙古境內的四種有毒環柄菇，并進行了鑒定驗證，四種菇均有不同程度的毒性，其中肉褐鱗環柄菇 L.brunneoincarnata Chodat&C.Martín為極毒菌，誤食后會導致肝腎、呼吸衰竭，死亡率極高，其他三種誤食后均表現為胃腸型中毒癥狀。冠狀環柄菇L.cristata（Bolton）P.Kumm.重金屬含量高，對人體有害[15]，所以不宜食用。該結果為有毒環柄菇的識別提供方便，為菌物資源的鑒定及安全開發提供依據。