磁珠綁定DNA分子在納米孔中易位研究

邵麗影 陳海洋

摘要：納米孔檢測單個DNA堿基的挑戰(zhàn)在于DNA通過納米孔的速度過快以至于無法獲得有效的數(shù)據(jù)點。本文通過綁定磁珠來降低DNA的易位速度，DNA分子是通過非共價鏈霉親和素-生物素鍵連接在磁珠上，并證明在800mV電壓下，被捕獲的DNA與磁珠會斷裂從而從納米孔中釋放出來。測量綁定磁珠的DNA通過納米孔的阻塞離子電流軌跡，統(tǒng)計DNA易位事件的持續(xù)時間。DNA與磁珠綁定后，DNA易位的速度降低。

關(guān)鍵詞：納米孔；DNA；磁珠；過孔時間

引言

得益于低成本高通量的特性，納米孔檢測技術(shù)廣泛的應用于快速分析生物分子（DNA，RNA，蛋白質(zhì)等），以及生物分子之間的相互作用。該技術(shù)通過外加電場驅(qū)動待測分子通過納米孔，同時檢測單個分子通過納米孔時引起的離子電流信號變化來分析單分子的性質(zhì)。納米孔檢測技術(shù)能在一秒鐘內(nèi)獲得上億個信號，即不需要標記被檢測物，也不需要將分析物錨定在基底上。但是目前該技術(shù)面臨的瓶頸問題在于，待測分子受電場力驅(qū)動通過納米孔的速度過快。檢測過程中，難以采集到足夠的電流信號數(shù)據(jù)點，無法辨識待測分子細微的結(jié)構(gòu)特征。例如，DNA分子在200mV電壓驅(qū)動下通過固態(tài)納米孔的速度約為30 base/μs[1]。而現(xiàn)有的商品化膜片鉗檢測系統(tǒng)的最大采樣頻率為250kHz，每一次采樣都會有上百個堿基通過，因此難以根據(jù)電流信號的變化分辨出DNA分子上的每一個堿基分子。針對這一問題，F(xiàn)ologea等[2]通過調(diào)控偏置電壓、溶液濃度、溫度以及粘度的方式降低DNA分子的過孔速度。但是這一類方法同時會導致過孔電流信號的幅值降低。直接在待測分子施加與電場力相反的力是實現(xiàn)控制過孔速度的最有效方法。劍橋大學卡文迪實驗室的Keyser等[3]人最先設(shè)計并搭建了光鑷裝置，通過在DNA分子上施加機械力達到控制其運動的目的。光鑷能夠控制DNA分子在納米孔中的位置達到納米級精度[4]，該方法還擴展至對蛋白質(zhì)覆蓋的DNA分子[12]以及單根RNA分子[5]的操控。但是光鑷系統(tǒng)操控復雜且只能控制單個待測分子，喪失了納米孔單分子傳感器相對于傳統(tǒng)單分子檢測技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)并行檢測的重要優(yōu)勢。與光鑷相比，磁鑷在理論上可以實現(xiàn)多個待測分子過孔的并行控制[6]。但是目前仍缺乏將DNA綁定在磁珠上后，DNA分子在納米孔中易位過程的系統(tǒng)研究。

本文通過實驗研究了綁定在磁珠的DNA分子在外加電場驅(qū)動下通過在納米孔中的易位過程，觀察到將DNA分子綁定在磁珠上能夠有效降低其過孔速度，并分析了磁珠影響DNA分子的運動速度機理，以及在磁珠綁定情況下DNA分子的過孔姿態(tài)。

1 實驗原理和方法

1.1實驗原理

實驗原理如圖1（a）所示，兩個充滿溶液的液池通過納米孔相連，將Ag / AgCl電極分別浸入液池中，通過膜片鉗放大器在納米孔兩端施加電壓，從而形成基準離子電流并驅(qū)動DNA分子通過納米孔。當DNA分子通過納米孔時，可利用膜片鉗放大器（AXON 700B）檢測到脈沖離子電流信號。圖1（a）中，黃色球狀為磁珠，紅色鏈狀為DNA分子。DNA分子通過非共價鏈霉親和素-生物素鍵連接到磁珠上。本實驗所采用DNA分子為雙鏈lambda DNA（共有48kbp，直徑約2.2nm，長度約16.5μm）；磁珠表面修飾鏈霉親和素（直徑為1.2-1.5μm，購于Sigma公司），其形態(tài)如圖1（b）所示；本文中使用納米孔直徑為33nm；溶液為1 M KCl（pH=8，緩沖液為10mM Tris-HCl，1mM EDTA）；所有實驗均在法拉第籠中完成。

1.2 納米孔的制備

氮化硅納米孔的制備首先采用低壓化學氣相沉積方法（LP CVD）在硅基底兩側(cè)分別沉積100nm厚的氮化硅薄膜。通過光刻、反應離子刻蝕（RIE）工藝在氮化硅表面刻蝕出釋放窗口。采用質(zhì)量分數(shù)為25%的四甲基氫氧化銨（TMAH）溶液刻蝕釋放窗口露出的硅基地，得到自支撐的氮化硅薄膜。利用聚焦離子束（FIB）減薄局部氮化硅膜的厚度。最后，在減薄區(qū)域利用FIB制備納米孔，納米孔直徑的大小取決于刻蝕的時間以及離子束束流大小。為了納米孔芯片上的有機污染物，降低檢測過程中的1/f噪音。制備完成的納米孔用于實驗前需用180℃的食人魚溶液（體積比V（H2S04）：V（H2O2）=3：1）浸泡20min，之后用去離子水清洗。

1.3 磁珠和DNA分子綁定

DNA分子綁定到磁珠之前需將DNA分子生物素化，即將生物素連接到DNA分子的一端。該過程主要包括雜交、提純和將專門設(shè)計的引物連接到lambda DNA的cos位點 [7]。雜交主要運用聚合酶鏈式反應（PCR）技術(shù)，它類似于DNA的天然復制過程。完成雜交后的DNA包含酶和引物等雜質(zhì)，需要提純。DNA提純主要是用苯酚-氯仿法，其原理是利用酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復抽提，使蛋白質(zhì)變性。最后，在生物素化的DNA溶液中加入5μL的磁珠懸浮液和100mL緩沖液（100mM KCl，10mM Tris-EDTA），在室溫下靜置15分鐘，即完成磁珠和DNA的綁定。

2 實驗結(jié)果與討論

首先，將綁定DNA分子的磁珠加入cis側(cè)液池，施加800mV偏置電壓，檢測到的離子電流信號如圖3（a）所示，出現(xiàn)了大量下降的脈沖信號，說明出現(xiàn)了分子過孔事件。由于磁珠的體積遠大于納米孔，無法通過納米孔，因此綁定在磁珠上的DNA通過納米孔的前提是DNA能夠與磁珠分離。磁珠表面的聚苯乙烯通過共價鍵與鏈霉親和素連接，DNA通過共價鍵與單個生物素分子連接，然后它們通過非共價鏈霉親和素-生物素鍵連接。因此，DNA分子與磁珠綁定結(jié)構(gòu)中非共價鏈霉親和素-生物素鍵是最薄弱的一環(huán)[8]。

Merkel等人[9]使用原子力顯微鏡（AFM）對鏈霉親和素-生物素鍵的強度進行了測試，實驗表明鏈霉親和素-生物素鍵的強度在5～170pN。當緩沖液為濃度范圍在0.02～1M的氯化鉀鹽溶液時，單個DNA分子上所受到的力與外加電勢成正比關(guān)系，其中，比例系數(shù)約為0.24±0.02pN mV-1。在本實驗中，電壓為800mV，可以估計出DNA分子受到的力約為192pN。因此，可以認為DNA分子在電場力作用下進入納米孔，導致鏈霉親和素-生物素鍵斷裂，掙脫與磁珠的綁定。通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)綁定磁珠的DNA分子平均過孔時間為24.25 ms，即平均速度為0.68 μm/ms。因此，僅僅將DNA綁定在磁珠上可以有效降低DNA易位過孔的速度約兩個數(shù)量級。主要原因兩個方面。首先，由于磁珠在溶液中無法被電場驅(qū)動，DNA分子的運動會受到來自磁珠的反向拖拽力；其次，磁珠的體積遠大于納米孔，DNA分子只有掙脫與磁珠的綁定才能通過納米孔。

3 結(jié) 論

本文研究分析了自由狀態(tài)的DNA分子以及綁定在磁珠的DNA分子在外加電場驅(qū)動下通過在納米孔中的易位過程。實驗發(fā)現(xiàn)將DNA綁定在磁珠上可以有效降低DNA易位過孔的速度。

參考文獻

[1]Zhang H，Zhao Q，Tang Z，et al. Slowing down DNA translocation through solid-state nanopores by pressure[J]. Small，2013，9（24）：4112-7.

[2]Fologea，D.，et al.，Slowing DNA translocation in a solid-state nanopore. Nano Letters，2005. 5（9）：p. 1734-1737.

[3]Keyser，U.F.，et al.，Direct force measurements on DNA in a solid-state nanopore. Nature Physics，2006. 2（7）：p. 473-477.

[4]Sischka，A.，et al.，Single beam optical tweezers setup with backscattered light detection for three-dimensional measurements on DNA and nanopores. Rev Sci Instrum，2008. 79（6）：p. 063702.

[5]Hall，A.R.，et al.，Electrophoretic Force on a Protein-Coated DNA Molecule in a Solid-State Nanopore. Nano Letters，2009. 9（12）：p. 4441-4445.

[6]Van den Hout，M.，et al.，Direct Force Measurements on Double-Stranded RNA in Solid-State Nanopores. Nano Letters，2010. 10（2）：p. 701-707.

[7]Peng，H.B. and X.S.S. Ling，Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers. Nanotechnology，2009. 20（18）.

[8]Peng H，Ling X S. Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers.[J]. Nanotechnology，2009，20（18）：185101.

[9]Merkel R，Nassoy P，Leung A，et al. Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy.[J]. Nature，1999，397（6714）：50-3.

（作者單位：東南大學機械工程學院）