抗菌藥物耐藥性應對策略研究進展＊

黃 祺，唐洪波，胡明冬，梁華平

抗菌藥物耐藥性（AMR）是微生物（如細菌，病毒和一些寄生蟲）阻止抗菌藥物（如抗生素，抗病毒藥物和抗瘧藥）對抗它的能力［1］。抗生素耐藥菌近年來在全球迅速而廣泛地傳播，由于AMR的出現，使得傳統標準治療策略變得無效，并且存在傳播給其他人的風險。根據現有的研究報道，全球每年約700 000人死于抗生素耐藥性，盡管目前很難預估AMR的發生率及死亡率，但預計到2050年，抗生素耐藥性導致的死亡人數將增加到每年1000萬，經濟負擔為100萬億美元。不幸的是，盡管目前已有應對AMR的策略，但抗菌藥物的耐藥率預計仍會不斷地增長［2-4］。2009年—2016年中國臨床分離菌株（CHINET）細菌耐藥性監測結果可以發現，中國的AMR形勢也十分嚴峻［5］。在2016年在杭州召開的 G20峰會上，AMR問題亦被提上各國領導人討論議程，可以看出AMR問題在全球越來越受重視。作為醫務工作者，我們對AMR的認識仍需不斷深入，對其治療新技術的研究進展更需系統地了解，筆者整合了近5年來國內外最新文獻，現就快速診斷技術、抗生素新藥研發、老藥新用、抗菌藥物聯合運用、噬菌體療法、免疫療法、基因編輯技術運用等對策進行概述，鑒于筆者前期發表的綜述已撰寫了部分措施，該文則重點對快速診斷技術、抗生素新藥研發、老藥新用、免疫療法、基因編輯技術運用等對策進行綜述。

1 快速診斷技術

機體感染病原菌后，針對病原菌及藥敏的檢測至關重要，特別是在耐藥菌感染方面。因早期經驗性選用的抗生素可能對該病原菌不敏感，所以若能早期快速獲得準確病原菌及耐藥情況，將為臨床選用更具針對性及有效性抗生素提供重要作用。目前針對病原菌的快速診斷方法主要包括表型篩查和基因檢測。表型篩查主要包括 E-test法、改良Hodge 實驗等［6］，但這類方法往往耗時長、特異性差、靈敏度低，極易出現假陽性或假陰性結果。基因檢測主要包括普通PCR法、熒光定量PCR法、環介導等溫擴增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、基因芯片技術等［7，8］，這些方法具有快速、特異及敏感等優點。而針對病原菌耐藥情況的檢測除針對基因檢測外，目前針對蛋白檢測更加優勢，主要包括LC-MS/MS法和PCR-P法。LC-MS/MS法首先獲得待測菌株的全蛋白溶液并進行蛋白電泳，多個蛋白條帶分別進行酶解后，通過LC-MS/MS獲得各條帶對應的特異性肽指紋圖譜，之后采用Mascot將LC-MS/MS檢測結果在Swis-sProt數據庫中的細菌分類中進行搜索比對，即可判斷待測菌株是否為陽性耐藥菌株，該技術除了對產碳青霉烯酶的培養粗提物進行檢測外，也成功檢測到了動物感染血液中的碳青霉烯酶的存在［9］，新技術的進步對早期耐藥菌感染的確診，并對其開展相應治療具有重要作用。

2 新藥研發

眾所周知，新型抗菌藥物的研發周期長，資金需求大，研發的速度滯后于細菌對抗生素產生耐藥的速度。盡管開發新抗生素的努力從未停止，但新藥獲批的數量在過去幾年卻逐步減少。自2010年以來，很少有新的抗生素獲得FDA和（或）EMA批準用于抗多藥耐藥G-菌的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗，這其中就包括：頭孢唑嗪/他唑巴坦，頭孢他啶/阿維嘧啶，美羅培南/他巴比妥，Plazomicin 及 Eravacycline［10］。20世紀70年代以來，僅有2種新型抗菌藥物［利奈烷酮類（利奈唑胺）及環脂肽類（達托霉素）］上市并投入臨床［11］。近年來，科研人員一直堅持不懈地篩選具有殺滅耐藥菌的有效物質，就有學者利用MDR感染的線蟲模型，對1300多種藥用植物內生真菌提取物進行抗耐藥菌作用篩選，并成功發現了4種抗耐藥菌有效的提取物。2015年，一種少見的縮肽類化合物被發現并命名為Teixobactin，該化合物多種多重耐藥菌有很強抗菌活性，且目前未見有對此藥耐藥的相關報道，美國NovoBiotic Pharmaceuticals公司現正對其進行進一步研發。此外具有較好抗耐藥菌能力的納米化抗生素 （如納米金，納米銀）也在被進一步被研發［5］。綜上，新藥研發策略將給耐藥菌的治療帶來了新的希望。

3 老藥新用

抗菌藥物老藥新用指的是將抗菌藥物通過采用現代分析和藥效、藥代動力學等方法對舊抗菌藥物重新開發并利用，多黏菌素的臨床新運用就是該策略成功的一個案例［12］。2010年新德里金屬β內酰胺酶-1（NDM-1）超級細菌被首次報道以來，大部分抗菌藥物對之無效，曾一度引起人們恐慌。之后有學者研究報道，多黏菌素在體外具有顯著的抗超級細菌能力。目前在全球大多數地區，多黏菌素對G-菌依舊敏感，耐藥檢出率處于較低水平，因其顯著的抗G-多重耐藥菌療效，而被作為危重病患者抗感染治療的最后防線之一。隨著研究繼續深入，磷霉素、夫西地酸等老藥因在抗MDR菌方面的顯著療效也重獲關注［5］。老藥新用策略的合理使用，將更有效利用現有資源，并將可能產生的耐藥性最小化。

4 免疫療法

4.1 抗體 抗體是指機體在抗原刺激后而產生的具有保護作用的蛋白質，在人體被動免疫反應中發揮重要作用。因在前期動物實驗過程中發現了抗體在抗多重耐藥菌感染的積極療效，日益受到關注。但目前大多數抗體藥物正處于臨床試驗階段（表1）。

表1 抗多重耐藥菌感染的抗體

眾所周知，多重耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）已經成為臨床感染上主要的耐藥陽性菌，MRSA在機體中引起炎癥反應及生物膜的形成需要脂磷壁酸參與，Biosynexus公司針對脂磷壁酸研制出的嵌合抗體Pagibaximab，目前該藥物已開展相關臨床試驗。隨著廣譜抗生素在臨床的廣泛使用，重癥患者發生腸道艱難梭菌耐藥菌感染風險逐漸增加，Merck公司研發了針對艱難梭菌毒素的單抗Bezlotoxumab，并在2017年先后被FDA和歐洲藥品管理局批準上市，用于成人艱難梭菌的感染治療當中［13-16］。疫苗的研制為耐藥菌的治療提供了一種新手段。

4.2 疫苗 接種疫苗是預防和控制耐藥菌感染的新策略，是減少疾病發生、減少醫療費用的有效手段，在動物模型中取得一定療效并獲得關注。不過針對耐藥菌的疫苗的研究，目前大多處于臨床前試驗或臨床試驗階段。

Jiang等［17］將toxAm基因和pcrV基因組合到真核質粒pIRES上組成DNA疫苗pIRES-toxAmpcrV，在小鼠體內，抗銅綠假單胞耐藥菌感染中有一定療效。Merck公司針對金黃色葡萄球菌靶點IsdB設計的亞單位疫苗V710在恒河猴模型中表現出免疫保護作用［18］，針對艱難梭菌毒素A和毒素B設計的亞單位疫苗VLA84，臨床試驗志愿者在接種疫苗后體內抗毒素A和抗毒素B抗體滴度明顯增高，臨床預后獲得改善，該疫苗現已進入Ⅱ期臨床試驗［19］。當前結核桿耐藥菌在全球肆虐，而唯一針對結核分枝桿菌的疫苗卡介苗對敏感個體及已感染個體缺乏保護作用，H1/IC31疫苗是ESAT6蛋白和結核分枝桿菌抗原Ag85B輔以IC31佐劑制備而成，不過近期臨床試驗結果顯示，該疫苗可以有效增強感染患者保護性免疫能力［20］。

4.3 免疫佐劑 免疫佐劑又稱免疫調節劑或免疫增強劑，它可以增強免疫原性、抗體滴度，改變抗體產生的類型并引起或增強遲發超敏反應，現有研究報道其在對耐藥菌感染的治療中可起到輔助作用。早期研究報道了抗菌肽、克拉霉素、磷霉素等具有免疫調節活性的作用，并在抗耐藥菌感染中起了一定療效。近期報道的一種佐劑，以Cremophor EL-35作為表面活性劑，丙二醇作為輔助表面活性劑，該佐劑可以提高血清中免疫球蛋白（Ig）G和相關亞類（如 IgG1，IgG2a和 IgG2b，以及 IgA）的特異性免疫應答，并提高MRSA感染小鼠的存活率［21］。Tocotrienols（T3s）是鮮為人知的維生素E異構體，具有許多生物學特性，已被公認為免疫調節劑，在MRSA引起的傷口感染的小鼠模型，T3S聯合達托霉素運用可顯著提高達托霉素的療效［22］。

5 基因編輯技術的運用

抗生素耐藥性與抗生素的使用相生相伴，由于抗生素的大量應用，在動物及人體內可誘導出抗生素耐藥基因，這些基因進入環境以后，通過橫向轉移機制誘導耐藥菌的產生。目前通過（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）/常間回文重復序列叢集關聯蛋白（associated proteins，Cas）CRISPR-Cas 技術可與全基因組測序及耐藥性突變篩選結合，使得CRISPRCas工具成為研究熱點，并已經用于靶向特異序列的抗微生物制劑的設計生產［23，24］，通過 CRISPR/Cas技術對溫和及溶解性噬菌體進行編程，可以致敏并殺死具有抗生素抗性的細菌［25］。Citorik等利用CRISPR-Cas技術設計的靶向特定DNA序列的RNA導向核酸酶（RGNs），該酶可通過噬菌體或攜帶質粒的細菌有效地傳遞給微生物群體，靶向作用于微生物與抗生素耐藥性和毒力有關的基因序列，從而改善其耐藥性及減輕毒力提升感染小鼠模型的存活率［26］。有學者研究發現Cas9重新編程的靶向毒力基因可以殺死毒性金黃葡萄球菌，編程后的基因可破壞具有抗生素抗性基因的葡萄球菌質粒，并在小鼠在體實驗中驗證了其對金黃色葡萄球菌殺滅功效［27］。

綜上所述，當今全球AMR形勢十分嚴峻，對抗AMR之路任重道遠。盡管現在針對AMR已經有了較為系統的應對策略，如改進耐藥菌快速診斷技術、抗生素管理策略、抗生素新藥研發、老藥新用、聯合運用策略、噬菌體療法、抗菌肽療法、免疫療法、基因編輯技術等，但仍存在一定的局限性。部分策略尚處于研究的早期階段，不能用于臨床，或者臨床運用范圍較窄，效果有限，如基因編輯技術的實際運用，免疫佐劑、疫苗、抗體療法等策略。此外應當注意到，目前絕大部分新提出的抗生素耐藥性應對策略亟須等待下一步的臨床轉化，將研究成果轉化為確實可行、安全有效的臨床抗AMR的新手段、新策略。人們有理由相信在不久的將來，AMR難題逐步會被攻克，耐藥問題會得到有效解決。