HPLC法測定杏香兔耳風(fēng)中熊果苷和對(duì)苯二酚的含量

楊飛

摘 要：目的：建立杏香兔耳風(fēng)中熊果苷和對(duì)苯二酚含量測定方法。方法：采用HPLC法，以甲醇-0.4%磷酸水為流動(dòng)相，流速0.65mL/min，等度洗脫，檢測波長為286nm。結(jié)果：熊果苷進(jìn)樣量在0.35μg～3.5μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（r=1.0000，n=6），平均回收率為99.75%；對(duì)苯二酚進(jìn)樣量在0.025μg～0.25μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（r=1.0000，n=6），平均回收率為98.04%。結(jié)論：建立HPLC法同時(shí)測定杏香兔耳風(fēng)中熊果苷和對(duì)苯二酚的含量，為控制藥材質(zhì)量提供方法。

關(guān)鍵詞：杏香兔耳風(fēng)；熊果苷；對(duì)苯二酚；HPLC

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2019）05-0199-02

杏香兔耳風(fēng)（Ainsliaea fragrans Champ.）為菊科兔耳風(fēng)屬植物干燥全草，分布于長江流域及南方各省[1]，具有清熱、利濕、涼血、解毒功效，治療感冒咳喘、咽喉痛、腸炎、痢疾、泌尿疾病等癥[2-3]。藥理學(xué)研究表明，該屬植物具有抗菌、止血、保肝、細(xì)胞毒作用等[4-5]。化學(xué)成分主要有酚酸類、黃酮類和萜類等[6]。

杏香兔耳風(fēng)含量測定的研究報(bào)道較多，多以木犀草素、綠原酸、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸[7]等指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定，尚未見熊果苷或?qū)Ρ蕉拥戎笜?biāo)成分進(jìn)行含量測定報(bào)道。本文選擇熊果苷和對(duì)苯二酚作為指標(biāo)成分，采用高效液相色譜法同時(shí)測定其含量，為控制藥材質(zhì)量提供可靠方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-20AT系列高效液相色譜儀（日本島津）：LC-20AT液相色譜輸液泵、CTO-10AS柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器、LC-Solution色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；KQ-500DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，江蘇）；TGL-16型高速離心機(jī)（江蘇金壇市中大儀器廠）；AB135-S型十萬級(jí)電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，瑞士）。

1.2 植物與試劑

杏香兔耳風(fēng)于2013年6月采于貴州貴陽市，由河南大學(xué)李昌勤教授鑒定為菊科兔耳風(fēng)屬植物杏香兔耳風(fēng)Ainsliaea fragrans Champ。

熊果苷對(duì)照品（純度：HPLC≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：120715，供含量測定用）；對(duì)苯二酚對(duì)照品（純度：GC>99%，德國默克股份兩合公司，供含量測定用）；甲醇（色譜純）；水為純凈水（杭州娃哈哈百利食品有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取熊果苷對(duì)照品和對(duì)苯二酚對(duì)照品分別為3.5mg和0.25mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.35mg/mL熊果苷和0.025mg/mL對(duì)苯二酚混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.3.2 供試品溶液的制備

取杏香兔耳風(fēng)粉末（過70目篩）4.00g，置于100mL錐心瓶中，精密加甲醇（分析純）50mL，超聲（功率300W，頻率40kHz）30min，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，即得。

1.3.3 色譜條件[8～9]

色譜柱：PurospherstarRP-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸水（30：70）流速：0.65mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：286nm；進(jìn)樣量：4μL。熊果苷對(duì)照品和對(duì)苯二酚對(duì)照品及供試品的HPLC圖見圖1。

1.3.4 線性關(guān)系的考察

精密吸取2.1項(xiàng)下的熊果苷和對(duì)苯二酚混合對(duì)照品溶液，按杏香兔耳風(fēng)色譜條件，分別依次進(jìn)樣1、2、4、6、8和10μL，記錄各組分峰面積。

1.3.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取2.1項(xiàng)下的熊果苷和對(duì)苯二酚混合對(duì)照品儲(chǔ)備液4μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得熊果苷和對(duì)苯二酚的峰面積。

1.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取杏香兔耳風(fēng)樣品5μL，按上述杏香兔耳風(fēng)供試品溶液方法進(jìn)樣，分別在0、3、6、9、12和24h依法測定，測得熊果苷和對(duì)苯二酚的峰面積。

1.3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取杏香兔耳風(fēng)樣品6份，按上述供試品制備方法制成供試品溶液，按上述杏香兔耳風(fēng)色譜條件進(jìn)樣5μL，測定熊果苷和對(duì)苯二酚的峰面積。

1.3.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知熊果苷和對(duì)苯二酚含量的杏香兔耳風(fēng)粉末（過70目篩）6份，每份為400mg，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣5μL，記錄峰面積值。

1.3.9 樣品處理

（1）杏香兔耳風(fēng)水提醇沉物。取杏香兔耳風(fēng)粉末約50.00g，置于1000mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水500mL，加熱回流提取2h，抽濾得濾液，將濾渣加蒸餾水400mL，再加熱回流提取1h，將濾液稍濃縮后加95%乙醇使醇含量達(dá)到70%，醇沉，上清液濃縮，即得水提醇沉物。

（2）杏香兔耳風(fēng)乙醇/乙酸乙酯提取物。取杏香兔耳風(fēng)粉末50.00g，置于1000mL圓底燒瓶中，加入乙醇/乙酸乙酯500mL，加熱回流提取2h，抽濾得濾液，將濾渣再加相應(yīng)溶劑400mL，再加熱回流提取1h，合并兩次濾液，濃縮，即得相應(yīng)溶劑的提取物。

（3）杏香兔耳風(fēng)甲醇提取物。取上述乙酸乙酯第二次加熱回流后的濾渣置于1000mL圓底燒瓶中，加入甲醇500mL，加熱回流提取2h，抽濾得濾液，將濾渣再加甲醇400mL，加熱回流提取1h，合并兩次濾液，濃縮，即得相應(yīng)溶劑的提取物。

（4）樣品高效液相色譜法。精密稱取浸膏，用甲醇（色譜純）溶解制成供試品溶液，按上述杏香兔耳風(fēng)色譜條件均進(jìn)樣4μL，測定熊果苷和對(duì)苯二酚的峰面積。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系的考察

以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，熊果苷的回歸方程為Y=668115.01X+ 5579.18，r=1.0000，線性范圍：0.35～3.5μg；對(duì)苯二酚的回歸方程為Y=1E+06X+143.22，r=1.0000，線性范圍：0.025 ～0.25μg。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

峰面積結(jié)果計(jì)算RSD分別為0.30%和0.99%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

峰面積結(jié)果計(jì)算RSD分別為0.78%和1.87%，結(jié)果表明供試品中熊果苷和對(duì)苯二酚在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

峰面積結(jié)果計(jì)算RSD分別為1.31%和2.05%，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好。

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

記錄峰面積值，由回歸方程計(jì)算含量，按下式計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1和表2。

回收率%=（測得總量-樣品中含量）/加入對(duì)照品量×100%

2.6 樣品含量測定

記錄樣品峰面積值，根據(jù)回歸方程算出樣品中熊果苷和對(duì)苯二酚含量，最后得出相應(yīng)的百分含量。結(jié)果如表3。

3 討論

分別考察了甲醇-水、甲醇-磷酸水以及不同比例流動(dòng)相，最終選定效果較好的甲醇-0.4%磷酸水（30：70），分離效果好，峰形對(duì)稱，拖尾因子最小。當(dāng)較小的改變流動(dòng)相比例時(shí)，會(huì)使熊果苷和對(duì)苯二酚拖尾因子變大。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志[M].第79卷.北京：科學(xué)出版社，1996.

[2] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上海人民出版社，1977.

[3] ZHOU YB， HE SZ. Species and distribution of Ainsliaea medicinal plants in Guizhou[J]. China J Chin Mater Med，1998，23（7）：389.

[4] 李桂蘭，芮成.3種杏香兔耳風(fēng)提取物抑菌活性的研究[J].中國醫(yī)藥指南，2010，8（7）：45-47.

[5] 崔雪靖.復(fù)方半邊蓮和復(fù)方杏香兔耳風(fēng)保肝活性研究[D].河南大學(xué)，2014.

[6] 邢春秀，謝寧，楊念云，等.杏香兔耳風(fēng)的化學(xué)成分[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，2006，14（2）：39.

[7] 鄔浩杰，鄒盛勤.HPLC法測定不同產(chǎn)地杏香兔耳風(fēng)中綠原酸和木犀草素的含量[J].中國藥師，2014，17（6）：929-931.