血清miRNA-221單獨(dú)及聯(lián)合PSA相關(guān)指標(biāo)檢測在前列腺癌診斷中的意義

楊曉 張敏 張臘紅 潘峰

前列腺癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，是男性因癌死亡的第3位致死因子[1]。目前，用于輔助診斷前列腺癌的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)主要是前列腺特異性抗原（PSA）相關(guān)指標(biāo)，包括T-PSA、F-PSA、F/T-PSA；在長期臨床應(yīng)用中，PSA相關(guān)指標(biāo)表現(xiàn)出其特異度不足的缺點(diǎn)[2-3]。隨著“液體活檢”的提出，越來越多的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)受到臨床上的關(guān)注[4]。miRNA是一類長18～25nt的非編碼小RNA，與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。miRNA-221/222基因定位于X染色體p11.3區(qū)域內(nèi)，成簇分布的miRNA-221/222與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。前列腺癌患者的miRNA-221/222表達(dá)譜發(fā)生了變化，進(jìn)而導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞生長、凋亡、遷移等過程出現(xiàn)紊亂[6-7]。有研究顯示，miRNA-221在前列腺癌組織/細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于正常前列腺組織/細(xì)胞[8]。本研究觀察并比較了前列腺癌、良性前列腺增生和健康對照者外周血miRNA-221表達(dá)差異，并探討了miRNA-221單獨(dú)及聯(lián)合PSA相關(guān)指標(biāo)檢測對前列腺癌的診斷效能，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年3月至2017年8月收治的43例前列腺癌患者（均經(jīng)組織病理學(xué)確診）為前列腺癌組，其中杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院2例，浙江省腫瘤醫(yī)院41例；杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院同期就診的37例良性前列腺增生患者為良性增生組；杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院同期25例健康體檢者為健康對照組。排除心腎功能衰竭、嚴(yán)重肝膽疾病、合并其他惡性腫瘤者。3組對象年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 使用促凝真空采血管采集所有對象外周靜脈血5ml，待完全凝固后及時分離血清于2個EP管，-80℃保存。

1.2.2 PSA相關(guān)指標(biāo)檢測 使用化學(xué)發(fā)光儀（雅培i4000）檢測T-PSA、F-PSA，計(jì)算得到F-PSA/T-PSA。

1.2.3 血清miRNA-221檢測 （1）血清總RNA提取：①血清中加入1ml Trizol裂解液，漩渦震蕩混勻；②加入0.2ml三氯甲烷，劇烈搖動10s，室溫放置1min；③4℃，12 000g離心15min；④將上清液轉(zhuǎn)移至另1個新的無RNA酶離心管中，加入等體積的100%乙醇；⑤吸取全部樣品，加入帶有2ml收集管的離心柱，8 000g室溫離心15s，棄流穿液；⑥將剩余樣品轉(zhuǎn)移至離心柱，重復(fù)第5步；⑦往離心柱中加入700μl清洗緩沖液，輕蓋蓋子，8 000g室溫離心15s，棄流穿液；⑧重復(fù)第7步，用500μl清洗緩沖液洗滌離心柱2次；⑨將離心柱轉(zhuǎn)移至1個新的無RNA酶1.5ml離心管中，往硅膠膜中央滴加50μl DEPC水，4℃，10 000g離心3min洗脫RNA。（2）RT-PCR法檢測血清miRNA-221含量：使用RTPCR儀（MX3000P，美國安捷倫公司）對上述提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，總體系20μl，反應(yīng)條件：42℃30min，85℃10min。以hsa-miR-16為內(nèi)參，反應(yīng)體系20μl，反應(yīng)條件：95℃ 3min 變性，95℃ 12s，62℃ 40s；共40個循環(huán)。計(jì)算miRNA-221相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。單一指標(biāo)診斷效能的判斷采用ROC曲線分析；多個指標(biāo)聯(lián)合檢測診斷效能的判斷先采用logistic回歸方程計(jì)算預(yù)測概率，再進(jìn)行ROC曲線分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組對象miRNA-221及PSA相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果比較 前列腺癌組miRNA-221相對表達(dá)量、T-PSA水平、F-PSA水平均明顯高于健康對照組、良性增生組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；前列腺癌組、良性增生組F-PSA/T-PSA均明顯低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 3組對象miRNA-221及PSA相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果比較

2.2 miRNA-221單獨(dú)及聯(lián)合PSA相關(guān)指標(biāo)檢測對前列腺癌的診斷效能 與PSA相關(guān)指標(biāo)比較，miRNA-221診斷前列腺癌的AUC、約登指數(shù)、靈敏度均較低，特異度較高；miRNA-221聯(lián)合PSA相關(guān)指標(biāo)未提高對前列腺癌的診斷效能，見表2。

3 討論

血清PSA相關(guān)指標(biāo)是目前臨床應(yīng)用最廣泛的預(yù)測前列腺癌的腫瘤標(biāo)志物，隨著其發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，前列腺癌的早期發(fā)現(xiàn)與診斷有了明顯提高[9-10]。在臨床應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)PSA雖然具有組織特異性，但缺乏對前列腺癌診斷的特異度。前列腺炎、良性前列腺增生、前列腺相關(guān)檢查（直腸指檢、經(jīng)直腸超聲檢查等）均可引起PSA升高。有研究表明，聯(lián)合2種及以上指標(biāo)檢測對疾病的診斷效能高于單一指標(biāo)[11-12]。Dimitry等[12]發(fā)現(xiàn)血清中IL-8、TNF-α、sTNFR聯(lián)合PSA相關(guān)指標(biāo)檢測前列腺癌，較單獨(dú)PSA相關(guān)指標(biāo)的靈敏度和特異度均有不同程度的升高。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合PLT、纖維蛋白原等檢測能提高PSA相關(guān)指標(biāo)對前列腺癌的診斷效能[13]。

表2 miRNA-221單獨(dú)及聯(lián)合PSA相關(guān)指標(biāo)檢測對前列腺癌的診斷效能

miRNA是一類長18～25nt的非編碼小RNA，其表達(dá)水平受到染色體重排（缺失、重復(fù)、突變等）、啟動子甲基化及轉(zhuǎn)錄活性等調(diào)控機(jī)制的影響[5]。近年來研究表明，miRNA能通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化，進(jìn)而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。隨著大量腫瘤特異性miRNA表達(dá)譜被發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤診斷、分級、預(yù)后中的作用引起研究者們的關(guān)注。當(dāng)miRNA暴露于較惡劣的條件時，如煮沸、過酸、過堿、反復(fù)凍融等，miRNA依然可以保持較高的穩(wěn)定性。因此，miRNA被認(rèn)為是理想的無創(chuàng)診斷標(biāo)志物候選者。研究發(fā)現(xiàn)，血清miRNA-210、miRNA-21診斷非小細(xì)胞肺癌的AUC為0.845、0.725；兩者聯(lián)合診斷的AUC為0.928，對非小細(xì)胞肺癌的診斷具有一定的診斷效能[14]。另一項(xiàng)研究表明，血清miR-767-3p診斷直腸癌的AUC、靈敏度和特異度分別為 0.770、0.800、0.680，而 miR-767-3p 聯(lián)合血清癌胚抗原診斷直腸癌的AUC、靈敏度和特異度分別為為0.862、0.730、0.840，聯(lián)合檢測有助于直腸癌的診斷[15]。有研究顯示，miR-221在胰腺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中表達(dá)失調(diào)，可以輔助疾病的診斷[16-18]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-221在前列腺癌組織/細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常前列腺組織/細(xì)胞。為了探討miRNA-221在前列腺癌無創(chuàng)診斷中的價值，筆者檢測了血清miRNA-221在前列腺癌患者、良性前列腺增生患者及健康對照者中的差異以及聯(lián)合PSA相關(guān)指標(biāo)檢測的效能。結(jié)果顯示，前列腺癌組miRNA-221相對表達(dá)量、T-PSA水平、F-PSA水平均明顯高于健康對照組、良性增生組（均P＜0.05）；前列腺癌組、良性增生組F-PSA/T-PSA均明顯低于健康對照組（均P＜0.05）。血清miRNA-221單獨(dú)及聯(lián)合PSA相關(guān)指標(biāo)對前列腺癌的診斷效能進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-221診斷前列腺癌的AUC為0.714，診斷價值中等（AUC 0.5～0.7為診斷價值較低，0.7～0.9為診斷價值中等，＞0.9診斷價值為較高），低于PSA相關(guān)指標(biāo)的診斷效能。當(dāng)約登指數(shù)最大時，miRNA-221具有較高的診斷特異度（0.984），但其靈敏度較低（0.333）。分析靈敏度較低的原因，可能由于血清中miRNA含量與組織細(xì)胞miRNA含量的異質(zhì)性，血清miRNA本身含量較低，或受檢測方法靈敏度的局限所致。血清miRNA聯(lián)合PSA相關(guān)指標(biāo)檢測時，對前列腺癌的診斷效能也無明顯改善。

綜上所述，血清miRNA-221在前列腺癌診斷中具有一定的臨床意義，其特異度較高，但靈敏度偏低；聯(lián)合PSA相關(guān)指標(biāo)檢測并未提高對前列腺癌的診斷效能。