新疆石榴皮HPLC指紋圖譜研究

常占瑛 劉桂花 王梅 古麗巴合爾?卡吾力 布魯根

摘要：目的? 建立新疆石榴皮HPLC指紋圖譜。方法? 采用Agilent SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%三氟乙酸溶液，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)370 nm，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定12批石榴皮樣品，運(yùn)用相似度分析軟件建立石榴皮指紋圖譜共有模式，并對(duì)色譜峰進(jìn)行指認(rèn)。結(jié)果? 建立了石榴皮HPLC指紋圖譜，標(biāo)定了18個(gè)共有峰，3個(gè)色譜峰得到指認(rèn)，分別為α-安石榴苷、β-安石榴苷、鞣花酸。結(jié)論? 本研究建立的石榴皮HPLC指紋圖譜方法穩(wěn)定可行，可用于控制石榴皮質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：石榴皮;指紋圖譜;高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：R284.1? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）04-0074-04

石榴Punica granatum L.為石榴科Punicaceae石榴屬Punica L.落葉灌木或小喬木，別名安石榴[1]。石榴原產(chǎn)于地中海及亞洲西部地區(qū)，約公元前2世紀(jì)傳入我國(guó)。目前，我國(guó)栽培石榴主要有六大產(chǎn)區(qū)，新疆是我國(guó)最西部的石榴產(chǎn)區(qū)，種植主要分布在喀什、和田等地。石榴是一種藥食同源的植物資源，其葉、花、汁、籽、果皮、根皆可入藥。研究表明，石榴具有清除自由基、調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防心腦血管疾病、抗氧化、抗病毒、抗癌及改善婦女圍絕經(jīng)期綜合征等多種生理和藥理活性[2]。石榴皮在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有巨大的

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)民族醫(yī)藥科技人才項(xiàng)目（2016-3-10）;新疆維吾爾自治區(qū)高校科研計(jì)劃項(xiàng)目（XJEDU2017S021）

通訊作者：高曉黎，E-mail：xli_g@sina.com

應(yīng)用價(jià)值[3-5]，從1963年起收載入《中華人民共和國(guó)藥典》，用于治療久瀉、久痢、便血、脫肛、崩漏、白帶和蟲(chóng)積腹痛。

石榴皮含有多酚、黃酮、氨基酸、微量元素等多種化學(xué)成分。石榴多酚是石榴皮中多酚羥基化合物的總稱，主要存在于石榴果皮中，約為其干質(zhì)量的10.4%～21.3%，主要成分包括安石榴苷、沒(méi)食子酸、表兒茶素、石榴皮鞣素等，其中安石榴苷含量最高[4-5]。安石榴苷是目前發(fā)現(xiàn)僅存在于石榴多酚中的特異性成分，也是其主要的單一成分，約占石榴皮總酚含量的65.75%，遠(yuǎn)高于鞣花酸和石榴皮鞣素等成分，安石榴苷在體內(nèi)外均具有很強(qiáng)的抗氧化、抗癌、抗菌及抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[6-7]。本試驗(yàn)綜合運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)、主成分分析方法，對(duì)石榴皮進(jìn)行HPLC指紋圖譜研究，為其質(zhì)量控制提供參考。

1? 儀器與試藥

Agilent1220LC型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），AB135-S型電子天平（瑞士梅特勒公司），HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司），KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率200 W，頻率40 kHz）。

安石榴苷對(duì)照品（批號(hào)MUST-17052603，純度≥98.12）、鞣花酸對(duì)照品（批號(hào)MUST-18030601，純度≥99.65），成都曼斯特生物科技有限公司;色譜甲醇，三氟乙酸。12批石榴皮樣品（2015年10月采集，S1、S2、S3產(chǎn)地為和田策勒縣，S4、S5、S6產(chǎn)地為和田皮山縣，S7、S8、S9產(chǎn)地為喀什市，S10、S11、S12產(chǎn)地為喀什葉城縣）經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)·阿不力孜教授鑒定，均為石榴科植物石榴Punica granatum L.的成熟干燥果皮。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 色譜條件

色譜柱為Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸-甲醇，梯度洗脫（0～10 min，5%甲醇;10～25 min，20%甲醇;25～35 min，45%甲醇;35～45 min，65%甲醇），檢測(cè)波長(zhǎng)370 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。

2.2? 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取適量安石榴苷、鞣花酸對(duì)照品，置棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容、搖勻，制成每1 mL各含75 ?g的溶液，即得。

2.3? 供試品溶液的制備

精密稱定25 mg石榴皮，置容量瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放室溫至冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻混合，精密吸取5 mL至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻混合，過(guò)0.22 μm微孔有機(jī)濾膜，即得。

2.4? 樣品測(cè)定

精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄45 min色譜圖。

2.5? 方法學(xué)考察

2.5.1? 精密度試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.26%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.2? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.30%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3? 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件分析，測(cè)得各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.5%，相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6? 指紋圖譜的建立

2.6.1? 參照峰選擇

石榴皮中鞣花酸色譜峰（18號(hào)峰）峰形相對(duì)比較對(duì)稱，且含量穩(wěn)定，故將鞣花酸色譜峰定為石榴皮HPLC指紋圖譜的參照峰。

2.6.2? 共有峰標(biāo)定及化學(xué)成分指認(rèn)

取12批石榴皮樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，選擇較穩(wěn)定的色譜峰，結(jié)果共標(biāo)定了18個(gè)色譜峰為石榴皮HPLC指紋圖譜的共有指紋峰（見(jiàn)圖1、圖2）。12批石榴皮樣品指紋圖譜見(jiàn)圖3。采用面積歸一化法計(jì)算，18個(gè)共有峰的峰面積之和占總峰面積的90%以上，根據(jù)保留時(shí)間，指認(rèn)4號(hào)峰為α-安石榴苷，5號(hào)峰為β-安石榴苷，18號(hào)峰為鞣花酸。以鞣花酸色譜峰作為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果相對(duì)峰面積的RSD為0～2.97%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0～0.73%，具有非常強(qiáng)的一致性，符合指紋圖譜的技術(shù)要求（RSD<3%），見(jiàn)表1、表2。

2.6.3? 相似度分析

將12批石榴皮HPLC指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）》軟件中，對(duì)其相似度進(jìn)行分析。12批石榴皮指紋圖譜中主要峰群的整體圖貌基本一致，指紋特征峰的相對(duì)保留時(shí)間基本一致，表明四產(chǎn)地的樣品差異不大。相似度計(jì)算結(jié)果（見(jiàn)表3）表明，不同產(chǎn)地石榴皮化學(xué)成分的組成基本一致。石榴皮指紋圖譜中共標(biāo)定了18個(gè)共有峰，整個(gè)色譜圖可分為3個(gè)區(qū)域：第一指紋特征區(qū)的保留時(shí)間段約在0～22 min處，該區(qū)特征指紋峰較多，共6個(gè)，其中4號(hào)峰為α-安石榴苷，5號(hào)峰為β-安石榴苷，且二者相對(duì)含量較大，是整個(gè)指紋圖譜中較為重要的2個(gè)峰;第二指紋特征區(qū)的保留時(shí)間段約在22～28 min處，該區(qū)共有5個(gè)特征指紋峰，峰形較好且含量相對(duì)較小;第三指紋特征區(qū)的保留時(shí)間段約在28～40 min處，該區(qū)共有7個(gè)特征指紋峰，18號(hào)峰為鞣花酸色譜峰，因其含量較高、峰形較好、基本對(duì)稱，故以其作為石榴皮HPLC指紋圖譜的參照峰。

3? 討論

研究中藥指紋圖譜主要有化學(xué)方法和生物方法兩類。化學(xué)方法包括HPLC、質(zhì)譜指紋圖譜法、紅外光譜指紋圖譜法、紫外分光光度法及高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜法;生物方法包括DNA法和生物色譜法。其中以HPLC最為常用，具有較高分離效能、分析速度快、檢測(cè)靈敏性好、選擇性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)建立的石榴皮HPLC指紋圖譜信息量大、操作簡(jiǎn)便、外界因素影響可控，具有較高的色譜重現(xiàn)性且穩(wěn)定性良好，可用于石榴皮的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

在流動(dòng)相的選擇上，本試驗(yàn)嘗試了甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.5%磷酸、甲醇-乙腈-0.2%三氟乙酸[8]、乙腈-0.1%三氟乙酸、甲醇-0.1%三氟乙酸等溶劑系統(tǒng)作為流動(dòng)相，結(jié)果以乙腈-0.1%三氟乙酸與甲醇-0.1%三氟乙酸作為流動(dòng)相的分離效果、峰型均相差不大，因此，選擇采用甲醇-0.1%三氟乙酸作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

參考文獻(xiàn)：

[1] 蔡霞，劉悅，張芳芳，等.石榴的化學(xué)成分與質(zhì)量控制研究進(jìn)展[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014，16（1）：123-129.

[2] 畢曉菲，李勇.石榴化學(xué)成分及其保健功能的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（22）：356-360.

[3] 杜欣，葉盛英.石榴葉和石榴皮藥理活性研究進(jìn)展[J].天津藥學(xué)， 2007，19（2）：64-66.

[4] 林勇.石榴皮的化學(xué)、藥理與臨床研究概述[J].中藥材，2010，33（11）：1816-1819.

[5] 付軍，李正.石榴皮鞣質(zhì)的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥業(yè)，2011，20（24）：92-94.

[6] 李建科，李國(guó)秀，趙艷紅，等.石榴皮多酚組成分析及其抗氧化活性[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（11）：4035-4041.

[7] JIMENEZ D R M， RAMAZANOV A， SIKORSKI S， et al. A new method of standartization of health-promoting pomegranate fruit （Punica granatum） extract[J]. J Georgian Med News，2006，140：70-77.

[8] 羅玉琴，李洋，熱依木古麗·阿布都拉，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定石榴皮提取物陰道泡騰片中安石榴苷和鞣花酸[J].中草藥，2011，42（10）：2011-2013.

（收稿日期：2018-05-31）

（修回日期：2018-07-12;編輯：陳靜）