miR-145在心肌梗死大鼠心肌組織中的表達及意義

曾令勇 黎榮 黃俊 劉亮 余輝 錢冉

(1咸寧市中心醫院心血管內科，湖北 咸寧 437100；2湖北科技學院實驗診斷教研室)

研究表明心肌梗死引起的心肌細胞凋亡是引起心肌梗死后心室重構和心力衰竭的主要原因，抑制心肌細胞凋亡可顯著阻斷心肌梗死的發生〔1，2〕。miRNAs是一種非編碼RNA分子，可以和下游靶基因結合，調控靶基因轉錄或降解靶基因，從而對細胞的生長、增殖、分化、遷移、凋亡等生物學行為進行調控〔3〕。miR-145和血管平滑肌細胞表型分化關系密切，研究發現急性冠脈綜合征患者血漿miR-145水平下降〔4〕，miR-145與缺氧誘導的H9c2細胞損傷有關〔5〕。但miR-145在心肌梗死中的表達及其對心肌梗死的作用機制研究不多。本文對miR-145在心肌梗死大鼠心肌組織中的表達及其在心肌梗死中的作用機制進行研究。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：清潔級、雄性、健康、SD大鼠258只，體重180～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2008-0016。主要試劑：兔抗磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)單克隆抗體、兔抗磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)單克隆抗體、兔抗Bax單克隆抗體、兔抗Bcl-2單克隆抗體，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔抗體(美國Epitmics公司)，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、Trizol試劑盒、RT-PCR試劑盒(美國Tocris公司)，miR-145寡核苷酸模擬物(mimics)和miR-145 mimics陰性對照(廣州銳博生物科技有限公司合成)，TUNEL檢測試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司)等。

1.2心肌梗死模型建立 通過冠狀動脈左前降支結扎建立心肌梗死模型：水合氯醛麻醉成功后，剔除大鼠胸部和頸部毛發，碘伏溶液消毒頸部皮膚并做長1 cm切口，暴露氣管、連接呼吸機；胸部皮膚消毒后在左側第4根肋骨作為手術切口，剝離皮膚，暴露心臟，找到冠狀動脈左前降支并結扎，心電圖顯示ST段弓背向上抬高，左心室變白為心肌梗死模型建立成功。

1.3miR-145水平測定 取78只大鼠，隨機分為對照組和心肌梗死組，每組39只，對照組給予假手術處理(只進行冠狀動脈左前降支穿線，不結扎)，心肌梗死組建立心肌梗死動物模型。分別在建模1 d、3 d、7 d每組各處死13只大鼠，取大鼠心肌組織(心肌梗死組大鼠取梗死區心肌組織)，進行心肌組織中miR-145水平測定。采用Trizol試劑盒提取各大鼠心肌組織總RNA，檢測RNA純度，采用RT-PCR法測定大鼠心肌組織miR-145表達：將RNA逆轉錄并進行PCR擴增，PCR反應條件為94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃ 60 s，共35個循環。miR-145相對表達量以2-ΔΔCt表示。

1.4大鼠慢病毒轉染 另取180只大鼠根據隨機數字法分為假手術組、心肌梗死組、陰性對照組和miR-145組，每組45只，心肌梗死組、陰性對照組和miR-145組大鼠建立心肌梗死模型(方法同上)。miR-145組大鼠心肌組織局部注射攜帶miR-145 mimics慢病毒(4×107個)，陰性對照組大鼠心肌組織局部注射攜帶綠色熒光蛋白(GFP)慢病毒空載體(miR-145 mimics陰性對照，4×107個)，心肌梗死組大鼠和假手術組大鼠心肌組織局部注射等量生理鹽水，每天1次，共1 w。治療結束后，假手術組、心肌梗死組、陰性對照組和miR-145組各分3個亞組，每組中每個亞組分別為15只、14只、13只、14只大鼠。一個亞組大鼠用于心功能檢查和心肌梗死面積測定；一個亞組用于心肌細胞凋亡測定；一個亞組用于心肌組織中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白和mRNA水平測定。

1.5各組大鼠心功能檢查 治療結束后，水合氯醛麻醉，采用心臟彩超檢查，并記錄各大鼠的左心室收縮末期內徑(LVDs)、左心室舒張末期內徑(LVDd)、左心室長軸縮短分數(FS)、左心室射血分數(LVEF)等心功能指標。

1.6各組大鼠心肌梗死面積測定 上述大鼠心功能檢查后處死大鼠，取心臟組織，將大鼠心臟沿橫軸方向在心尖到結扎點之間進行切片，切片厚1 mm，進行TTC染色，紅色心肌組織為正常心肌組織，白色心肌組織為梗死心肌組織，拍照后采用IMAGE PRO圖像分析系統進行分析，計算心肌梗死面積占心肌面積的百分數。

1.7各組大鼠心肌細胞凋亡測定 取大鼠心肌組織，石蠟包埋后進行切片，采用TUNEL法測定心肌凋亡指數(具體方法嚴格按照試劑盒說明書進行)，二脒基苯基吲哚染色后，凋亡細胞呈棕黃色，在200倍光鏡下計算細胞凋亡指數，細胞凋亡指數=凋亡細胞/細胞總數×100%。

1.8各組大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白水平測定 取各大鼠心肌組織，勻漿，加入細胞裂解液裂解30 min，提取心肌組織總蛋白，采用BCA測定心肌組織蛋白濃度，采用Western印跡法測定心肌組織中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白水平，一抗為兔抗PI3K單克隆抗體、兔抗p-AKT單克隆抗體、兔抗Bax單克隆抗體、兔抗Bcl-2單克隆抗體，GAPDH單克隆抗體為內參照，PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白的相對表達量=PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.9各組大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2 mRNA水平測定 采用RT-PCR測定各組大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2 mRNA水平，具體方法同心肌組織miR-145表達量測定。

1.10統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠存活情況 假手術組大鼠存活45只，心肌梗死組大鼠建模成功并存活42只，陰性對照組大鼠建模成功并存活40只，miR-145組大鼠建模成功并存活42只。

2.2不同時間點心肌梗死大鼠梗死區心肌組織中miR-145水平 建模1、3、7 d，心肌梗死組miR-145水平均顯著低于對照組(P<0.001)。見表1。

表1 不同時間點心肌梗死組和對照組心肌組織中miR-145水平比較

2.3各組心肌組織中miR-145表達量及大鼠心臟功能比較 與假手術組比較，心肌梗死組和陰性對照組及miR-145組miR-145相對表達量明顯降低(P<0.05)；與心肌梗死組和陰性對照組比較，miR-145組miR-145相對表達量明顯升高(P<0.05)；心肌梗死組和陰性對照組miR-145相對表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)。與假手術組比較，心肌梗死組、陰性對照組LVDs和LVDd顯著升高(P<0.05)，FS和LVEF顯著降低(P<0.05)；與心肌梗死組和陰性對照組比較，miR-145組大鼠LVDs和LVDd顯著降低(P<0.05)，FS和LVEF顯著升高(P<0.05)；心肌梗死組和陰性對照組大鼠LVDs、LVDd、FS、LVEF比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心臟功能及心肌組織中miR-145相對表達量、心肌梗死面積和凋亡指數比較

與假手術組比較:1)P<0.05;與心肌梗死組比較:2)P<0.05;與陰性對照組比較:3)P<0.05;下表同

2.4各組心肌梗死面積和凋亡指數比較 假手術組無心肌梗死。與假手術組比較，心肌梗死組和陰性對照組及miR-145組心肌凋亡指數顯著升高(P<0.05)；與心肌梗死組和陰性對照組比較，miR-145組心肌梗死面積和凋亡指數顯著降低(P<0.05)；心肌梗死組和陰性對照組心肌梗死面積和凋亡指數比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖1和圖2。

2.5各組心肌組織中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白及mRNA水平比較 與假手術組比較，心肌梗死組和陰性對照組及miR-145組Bax蛋白水平及mRNA相對表達量均顯著升高(均P<0.05)，PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白水平及mRNA相對表達量均顯著降低(均P<0.05)；與心肌梗死組和陰性對照組比較，miR-145組Bax蛋白水平及mRNA相對表達量均顯著降低(均P<0.05)，PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白水平及mRNA相對表達量均顯著升高(均P<0.05)；心肌梗死組和陰性對照組PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白水平及mRNA相對表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3、圖3。

圖1 各組大鼠心肌梗死面積

箭頭所示為凋亡細胞圖2 各組大鼠心肌組織TUNEL染色(×200)

組別nPI3Kp-AKTBaxBcl-2PI3K mRNAp-AKT mRNABax mRNABcl-2 mRNA假手術組150.43±0.060.91±0.130.16±0.030.49±0.161.00±0.011.00±0.011.00±0.031.00±0.02心肌梗死組140.16±0.031)0.18±0.051)0.94±0.151)0.13±0.041)0.33±0.121)0.22±0.041)3.52±0.761)0.28±0.091)陰性對照組130.15±0.021)0.17±0.061)0.95±0.131)0.12±0.061)0.34±0.131)0.23±0.031)3.47±0.681)0.26±0.081)miR-145組140.31±0.051)2)3)0.65±0.071)2)3)0.37±0.071)2)3)0.27±0.111)2)3)0.52±0.211)2)3)0.48±0.161)2)3)1.94±0.321)2)3)0.61±0.151)2)3)F值132.991261.889207.74738.46077.192274.83777.902187.764P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

A:假手術組，B:心肌梗死組，C:陰性對照組，D:miR-145組圖3 各組大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白Western印跡電泳

3 討 論

miRNAs為一類高度保守的小RNA，長18～25 nt，可以和靶基因3′-UTR區域結合，抑制靶基因翻譯，從而調控細胞的增殖、分化和凋亡等，研究發現miRNAs和心肌缺血再灌注損傷、心肌梗死、心臟重構、心力衰竭等心血管疾病的發生發展關系密切〔6〕。miR-145位于人類染色體5q32上，有23個核苷酸組成，miR-145在血管平滑肌中高度表達，參與血管平滑肌的增殖和收縮表型的維持〔7，8〕，和動脈血管平滑肌的增殖和遷移關系密切〔9〕。研究發現miR-145在心腦血管疾病的發生發展中具有重要作用，如姜春玲〔10〕研究發現急性冠脈綜合征患者外周血單核細胞miR-145水平下降。Xu等〔11〕研究發現miR-145過表達可以通過靶向細胞程序性死亡基因(PDCD)4預防大鼠心肌梗死。Zhang等〔12〕研究發現急性心肌梗死的發生與血漿miR145水平降低有關，血漿miR145水平可用于預測心臟功能和心力衰竭的發生風險。Higashi等〔13〕研究發現miR-145可通過心肌細胞自噬修復梗死的心肌組織。但miR-145在心肌梗死心肌組織中的表達及其對心肌梗死的影響尚不十分清楚，本研究建立心肌梗死大鼠模型，發現心肌梗死大鼠心肌組織中miR-145水平下降，向梗死心肌組織中注射miR-145可減少心肌梗死面積，降低心肌凋亡指數，改善心功能，本研究結果提示miR-145參與心肌梗死的發生發展過程，miR-145可通過降低心肌細胞凋亡發揮保護心肌的作用。

細胞的凋亡受多種信號通路調控，PI3K/AKT具有抗凋亡通路之稱，是調控細胞凋亡信號通路中的一種〔14〕，PI3K/AKT信號通路可通過調控其下游的Bcl-2和Bax等多種靶蛋白的表達發揮對細胞生長、分化、凋亡、侵襲、遷移及血管形成等病理生理過程〔15，16〕。在心肌梗死中PI3K/AKT信號通路失活，激活PI3K/AKT信號通路可抑制心肌細胞凋亡〔17～19〕。在心肌缺血再灌注中，PI3K/AKT信號通路的激活及其對Bcl-2和Bax的調控可減少心肌細胞凋亡〔20，21〕。miR-145的生物學作用與PI3K/AKT信號通路的關系也比較密切，有研究發現miR-145通過PI3K/AKT信號通路卵巢上皮癌的發生發展〔22〕。本研究結果發現心肌梗死大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT、Bcl-2水平降低，Bax水平升高，對梗死心肌組織中注射miR-145后大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT、Bcl-2水平升高，Bax水平降低。本研究結果表明miR-145可能通過激活PI3K/AKT信號通路及調控PI3K/AKT下游Bcl-2和Bax靶蛋白水平發揮對心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡的抑制作用。